PKCα\βⅡ\η\ζ在肾血管性高血压大鼠中的表达

[摘要] 目的:研究PKCα、βⅡ、η、ζ在肾血管性高血压大鼠心肌中的表达,探讨PKC亚型在高血压发病机制中的作用。方法:肾血管性高血压大鼠模型制备成功后,提取部分心肌组织,采用Western Blot测定PKCα、βⅡ、η、ζ的表达情况。结果:PKCα、βⅡ、η、ζ表达在假手术组术前、术后无明显变化;手术组PKCα、βⅡ表达较术前无明显变化,PKCη表达较术前减少,PKCζ术后无表达。结论:PKCα、βⅡ可能未直接参与高血压的发病。PKCη术后表达下降考虑与高血压发病相关,然而其发病机制尚需进一步探讨,推测可能与其促进表皮细胞的增殖有关。PKCζ作用于AngⅡ诱导的ERK途径的活化,ERK激活增加,从而导致血管平滑肌细胞增殖,血压升高。PKCη、ζ在高血压的发生和发展过程中起重要作用。

[关键词] 肾血管性高血压大鼠;蛋白激酶C(PKC);细胞外信号调节激酶

[中图分类号] R-332[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2010)04(a)-027-03

The expression of protein kinase C α, βⅡ, η, ζ in rats with renovascular hypertension

WANG Haixia, LIU Shaokui, ZHANG Dianlong

(The Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University, Dalian 116001, China)

[Abstract] Objective: To investigate the expression of protein kinase C (PKC)α, βⅡ, η and ζ in rats with renovascular hypertension, and the effect of subtypes of PKC on hypertension was also investigated. Methods: Renovascular hypertension models of rats were established. PKCα, βⅡ, η and ζ were detected in cardiac muscle by Western Blot. Results: The expression of PKCα, βⅡ, η and ζ of sham-operation group had no obvious change before and after operation. The expression of PKCα and βⅡ of operation group after operation were the same as that before operation, the expression of PKC η after operation was decreased. PKCζ showed no expression after operation. Conclusion: PKCα and βⅡ may do not directly participate in the effect of hypertension. The expression decreasing of PKCη after operation would be related to the effect of hypertension, its pathogenesy should be further investigated. It may be related to the proliferation of epidermic cells. PKCζ can lead to vascular smooth muscle cell proliferation and rising of blood pressure through ERK activation pathway and upregulation of ERK, PKCη and ζ play important roles in the process of the occurrence and development of hypertension.

[Key words] Renovascular hypertension models of rats; Protein kinase C (PKC); Extracellularly responsive kinase (ERK)

随着生活水平的日益提高,高血压的发病率逐年上升,由此引起的心衰更成为危害人类健康并致死的主要危险因素之一。目前有关高血压的研究很多,但其发病机制尚未完全阐明,有报道认为蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)各亚型在高血压、心肌肥厚的发生及发展中起重要作用[1]。本文通过检测高血压大鼠模型心肌PKCα、βⅡ、η、ζ的表达情况,探讨PKC亚型在高血压发病机制中的作用。

1材料与方法

1.1肾血管性高血压大鼠模型的制备

实验选用42只正常血压Wistar大鼠,均为雄性,体重165～180 g,在大连医科大学实验动物中心进行实验(辽:scxk 2002-0002;辽:syxk 2002-0005)。大鼠随机分为正常对照组、手术组、假手术组。模型制备:氯胺酮麻醉后备皮,取腹部正中切口开腹,分离后暴露一侧肾动脉,针灸银针紧贴在左肾动脉,用手术丝线将两者一起结扎后,抽去银针,逐层关腹,术后腹腔内注射青霉素预防感染。假手术组除不结扎肾动脉外,其他手术步骤相同。术后10周肾血管性高血压大鼠模型成功建立[2],大鼠全部处死,取心肌组织,低温液氮下保存。

1.2 PKCα、βⅡ、η、ζ的提取和活性测定

取部分心肌组织提取蛋白并定量,用聚丙烯酰胺变性凝胶分离蛋白(上样量为40 μg总蛋白),将蛋白电转到硝酸纤维膜上,封闭后加一抗(1∶2 000稀释)、辣根过氧化物酶标记二抗(1∶1 000稀释),用化学发光试剂NCIP/BCIP显影,X线片压片曝光,凝胶成像分析系统分析结果,重复3次(全部一抗、二抗试剂来自Santa Cruz Biotechnology)。

1.3 统计学方法

数据以SPSS 10.0软件处理,组间进行t检验,P<0.05为差异有统计学意义,P<0.01为差异有高度统计学意义。

2 结果

2.1假手术组PKCα、βⅡ、η、ζ的表达情况

假手术组PKCα、βⅡ、η、ζ表达在术前、术后无明显变化(P>0.05)。见图1、2。

2.2 手术组PKCα、βⅡ、η、ζ的表达情况

手术组术后PKCα、βⅡ表达较术前无明显变化(P>0.05),PKCη表达较术前减少(P<0.05),PKCζ术后无表达(P<0.01)。见图3～6。

图3 手术组PKCα的表达 图4手术组PKCβⅡ的表达

(B.术前;A.术后) (B.术前;A.术后)

图5手术组PKCη的表达 图6手术组PKCζ的表达

(B.术前;A.术后)(B.术前;A.术后)

3讨论

目前尚不清楚心肌细胞感受血流压力变化的精确方式,以及由此引起的心肌相关信号通路活化及其在高血压心肌肥厚过程中调节心肌基因的确切机制。众多生长因子的分离和分子克隆提示了不同亚型的生长因子和细胞因子在高血压发病中的作用。

PKC是细胞内一条重要的信号传导通路中的关键因子,它是一种重要的丝氨酸/苏氨酸激酶,具有多种生理功能,细胞外信号通过膜上受体可将PKC启动,进而将底物蛋白磷酸化,以调控细胞的增殖、分化、离子转运和基因表达等重要活动。PKC至少有12种亚型或同工酶,这些亚型分布在不同组织中,可由不同的第一信使启动信息转录,各亚型的活化形式、活化程度、持续时间及细胞内定位各不相同,在不同的组织中亚型表达各不一样。

已有报道显示,PKC启动后能使肌钙蛋白I和T发生磷酸化,反射性抑制肌原纤维ATP酶活性,产生负性肌力作用,其次由于它能减少心肌细胞肌浆网Ca2+转运,从而减弱心肌收缩力,持续启动的PKC与心肌细胞之间的转导已被证实能够启动心房利尿肽及β2肌球蛋白基因,引起心肌肥厚。然而不同的同功酶在信号转导机制中起不同的作用,如PKCγ的启动可修饰Na+-K+-ATP酶,使其活性受抑制,且可以直接抑制细胞凋亡,与钙调磷酸酶相互作用,调节组织对心肌缺血损害的耐受性。

大量研究表明,PKC依赖的细胞信号传导是心肌缺血预处理IPC中的重要环节。目前认为,并非所有的PKC亚型都参与了预处理时的细胞信号传导。已有研究用免疫荧光技术证实了PKCα、β、δ及ε在成年大鼠心肌细胞中存在及IPC时在心肌细胞的转位。有学者研究发现,缺血预处理并没有改变PKCμ、β、δ在胞质和胞膜中的比例;在冠状动脉阻断/再灌注(O/R)后PKCε在胞膜中的比例与O/R重复次数呈正相关。而PKCα、γ、ζ、ι在胞膜中的比例升高则不明显。有目的地干扰PKCε基因的表达,可使心肌缺血预适应梗死面积扩大,心肌局部缺血过程中生理浓度的酒精消耗可激活PKCε而对心肌产生保护作用[3-4]。Anita等[5]报道,PKCα、βⅡ通过ERK依赖的信号途径参与VEGF的生成过程,由于VEGF mRNA及其蛋白表达上调,从而导致伴随PKCα、βⅡ和ERK活性增加。本研究发现,PKCα、βⅡ的表达在手术组手术前后无明显变化,推测PKCα、βⅡ可能未直接参与高血压的发病。

PKCη为新型PKC,激活需要Ca2+参与,不被PKC的激活剂佛波酯激活,有关PKCη的报道不多,高玖鸣等[6]发现PKCη的转基因过度表达未引起心脏负荷的加重。本研究中PKCη在手术组术后表达反而降低,考虑与高血压发病相关,然而其发病机制尚需进一步探讨。笔者推测可能与其促进表皮细胞的增殖有关。

PKCζ是非典型PKC家族成员,作为PKC家族的新成员,由于它的一级结构缺乏C2区,且在其调节区只拥有一个锌指结构,因此,PKCζ显示出与其他PKC明显不同的特性,且广泛参与细胞功能的调节[7]。作为信息分子,PKCζ在多种细胞外刺激因素诱导的胞内信号转导通路中发挥重要作用,如丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路、核转录因子-κB(nuclear transcriptional factor-κB,NF-κB)的活化和核糖体S6蛋白激酶通路等。许多研究表明,PKCζ的激活机制具有组织细胞特异性[8]。

AngⅡ刺激使Ras与Raf结合增加,但PKCζ抑制剂并不影响Raf与Ras的结合,PKCζ通过Raf非依赖性途径活化血管平滑肌细胞ERK1/2[9]。本研究中,PKCζ在手术组术后无表达也支持这一点,提示PKCζ在高血压的发生和发展过程中起重要作用,其表达下降可能是因ERK激活增加,从而导致血管平滑肌细胞增殖、血压升高。丁波等[10]报道,PKCζ能够介导AngⅡ,激活Ca2+-钙调节蛋白依赖性蛋白激酶,促进心肌成纤维细胞的增殖。同时PKCζ的减少也对血管内皮起到一定的保护作用,PKCζ通过VEGF参与了肾血管性高血压大鼠的发病,在Ras和PI3激酶突变、缺失的情况下,活化的PKCζ明显减少,Sp1与VEGF表达部分下调。PKCζ在G蛋白耦联受体的信号转导中的作用较清楚。PKCζ的一种突变体能激活ERK和SAPK途径,它的一种显性负相(dominant negative)突变体则抑制ERK的活化。值得注意的是,很可能这两种具有相反作用的突变体都参与了发病,PKCζ在功能上作为一种MEK激酶并应答于AngⅡ诱导的ERK途径的活化[11]。

PKC同工酶种类较多,其同工酶的组织分布、结构、功能、活性以及基因表达的调节机制不同,并且与体内多种病理生理过程的调节有关。因此,开发PKC同工酶特异性拮抗剂,将会对多种疾病,尤其是在心脑血管疾病的治疗中发挥重要作用[12]。

[参考文献]

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[5]Anita JM, Heidi RR, Shalini ST, et al. Role for protein kinase C-α in keratinocyte growth arrest [J]. Journal of Investigative Dermatology,2009,129:2365-2375.

[6]高玖鸣,吴信,孔德瀛,等.蛋白激酶Cη转基因过度表达未引起心肌肥厚和心衰——介绍转基因小鼠体内心功能评价方法[J].高血压杂志,2004,10(5):452-455.

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[10]丁波,黄韶玲,张世勤,等.蛋白激酶C-ζ介导血管紧张素Ⅱ激活的CCDPK对大鼠心肌成纤维细胞增殖的影响[J].中国药理学报,2000,21(2):174-178.

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[12]龙刚,龚瑾,王西墨,等.灯盏花提取物对心脏移植异基因大鼠蛋白激酶C的作用[J].天津医药,2005,33(5):281-283.

(收稿日期:2010-01-14)