巴戟天低聚糖对Aβ2535致拟痴呆模型大鼠的保护作用

计划项目（090603）

[通信作者] *林励，研究员，博士生导师，Tel：（020）39358270， Email： ll76611@yahoo.com.cn

[作者简介] 陈地灵，博士后，Email：diling0828@sina.com

巴戟天为茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How.的干燥肉质根。味甘、辛，性微温，有补肾阳、强筋骨、祛风湿之功效。主要分布在福建、广东、广西、海南等省的热带和亚热带地区，是我国著名的“四大南药”之一。巴戟天中主要含有糖类、蒽醌、氨基酸、脂类、有机酸等化合物及无机元素[1]。其中，低聚糖类物质含量较高，成分复杂，药理作用明显[27]，具有十分广阔的开发应用前景。为阐明其抗痴呆药效学，本研究以Aβ损伤SD大鼠为模型，采用试剂盒酶标仪法测定脑组织中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽还原酶（GSHPx）等氧化指标，以及乙酰胆碱（ACh）和乙酰胆碱酯酶（AChE）以及Na+/K+ATPase等含量。考察OMO对Aβ2535致拟痴呆模型大鼠的影响，以期为阐明其抗痴呆药效提供研究基础。

1 材料

1.1 仪器 桌面型数字式双臂大鼠脑立体定位仪（瑞沃德生命科技有限公司）；Thermo D37520型高速冷冻离心机（德国Heraeus公司）；Phs25型pH计（上海精密科学仪器有限公司）；GenPure超纯水系统（德国TKA公司）；KQ500型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BP211D电子天平（d=0.01 mg，德国Sartorious）；水浴箱；微量移液器；酶标仪（瑞沃德生命科技有限公司）；佳美SK1快速混匀器（江苏金坛市佳美仪器厂）。

1.2 试药 巴戟天低聚糖（OMO， 自制，经鉴定其纯度>95%）加蒸馏水配成40 g·L-1，备用。阳性药盐酸多奈哌齐片研碎用前蒸馏水配置成混悬液0.125 g·L-1，备用。Aβ2535（Sigma公司），取Aβ25～35用无菌生理盐水配制成2 g·L-1，-20 ℃保存。聚集态的Aβ2535形成：Aβ2535溶液在37 ℃保温箱中放置7 d，使其变为聚集态的Aβ。SOD，MDA，CAT和GSHPx等氧化指标，以及ACh，AChE和Na+/K+ATPase等测试试剂盒购买于南京建成生物有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.3 动物 SD大鼠，SPF级，3月龄，84只，雄性，体重180～220 g，饲养环境SPF级，广州中医药大学实验动物中心，动物质量合格证号SCXK（粤）20080020，动物使用许可证号SYXK（粤）20080085。

2 方法

2.1 动物分组及造模、给药方案 SD大鼠适用性饲养3 d后随机分成6组，空白对照组、假手术组、模型组、阳性药安理申组（0.125 mg·kg-1）、巴戟天低聚糖高、低剂量组（60，20 mg·kg-1），平均每组14只。大鼠用30 g·L-1的戊巴比妥钠（40 mg·kg-1）麻醉后，头顶部去毛，消毒皮肤并切开，在颅骨上用牙钻对称打2个孔（AP -3.6 mm，ML±2.5 mm，DV 3.0 mm）即为海马区注射点。每侧注射5 μL（10 μg）聚集态的Aβ2535，在5 min内注完，并留针5 min。用骨蜡填补针孔，缝合皮肤并肌肉注射青霉素。空白组不做手术处理，假手术组（用以排除手术本身的影响）在海马内注射等量的生理盐水。大鼠手术后单笼饲养至完全清醒，再同组合并。造模后第15 天开始给药。

2.2 OMO对模型大鼠体重和脏器指数的影响 每天观察动物的外观体态（毛、色、形）和动态并作相应记录，每隔2 d测量动物体重1次，行为学检测后，处死动物，取脑、肾、脾脏、睾丸等进行相关指标检测。脏器系数=脏器质量/体重×100%。

2.3 OMO对模型大鼠氧化应激、能量代谢及胆碱能系统的影响 称取大鼠左半脑组织加9倍生理盐水制成10%匀浆，3 500×g离心10 min，取上清液，依次测定总蛋白，SOD，MDA，GSHPx，CAT，Na+/K+ATPase，ACh，AChE等指标。

2.4 统计学处理 实验数据用SPSS 16.0统计软件进行各实验组间的比较，用Dunnett′s检验进行各试验组与对照组比较。

3 结果

3.1 OMO对模型大鼠体重及脏器系数的影响 给药期间，模型组及高剂量组各有1只动物死亡，其表现为大便干燥，肚子肿大，消瘦。各给药组毛色比模型组明显光滑，未见其他异常情况。体重检测结果显示，各组动物体重差异没有显著性，提示造模和给予不同药物和不同剂量，对动物体重影响不大。对大鼠脏器系数的影响结果见表1。

表1 OMO对Aβ2535致拟痴呆模型大鼠脏器系数的影响结果（±s）

Table 1 The organ coefficient of the rats treated by Aβ25～35（±s）

注：与空白组比较1）P<0.01；与模型组比较2）P<0.05， 3）P<0.01（表2，3同）。

3.2 OMO对模型大鼠氧化应激、能量代谢及胆碱能系统的影响 与空白组比较，模型组大鼠脑组织中SOD，CAT和GSHPx活力均显著降低，MDA含量升高，差异具有统计学意义（P<0.01），提示Aβ模型大鼠脑内抗氧化酶类活力下降，抗氧化活性降低，出现氧化应激改变。口服给予OMO 25 d后各剂量组动物脑内氧应激均得到一定的改善，表现为大脑组织中SOD，CAT，GSHPx活力增加，MDA含量降低，其中高剂量组疗效最好（P<0.01），提示OMO可改善脑内氧化应激和自由基损害，有利于保护脑组织免受氧化损伤，见表2。

Na+/K+ATPase是能量代谢的关键酶，在ATP合成与细胞内的Na+/K+离子交换起着重要的作用，该酶的活性是评价各种细胞能量代谢及功能有无损伤的重要指标。与空白组比较，模型组大鼠脑组织中的Na+/K+ATPase活性显著降低（P<0.01），提示Aβ对脑内神经细胞的能量代谢有明显的影响。给予OMO治疗后该酶活性有显著升高，各剂量组均可显著提高脑组织中Na+/K+ATPase活性，见表3。

ACh被认为与学习和记忆有关，AChE为分解ACh的酶。本实验结果显示，与空白组比较，模型组大鼠脑组织中乙酰胆碱酯酶升高，乙酰胆碱降低，提示Aβ损害大鼠胆碱能系统而使之表现为拟痴呆特

表2 OMO对Aβ2535致拟痴呆模型大鼠氧化应激水平的影响（±s，n=8）

Table 2 Effect of OMO on oxidative stress activities in brain tissue of Aβ2535treated rats（±s，n=8）

表3 OMO对Aβ2535致拟痴呆模型大鼠能量代谢及胆碱能系统的影响（±s，n=8）

Table 3 Effect of OMO on engery metabolize levels， ACh and AChE activities in brain tissues of Aβ2535treated rats（±s，n=8）

征。给予OMO治疗后该酶活性有降低，与阳性药组比较有显著性差异（P<0.01），但高于阳性药组；OMO各剂量组均可显著提高ACh含量，使其水平恢复至正常范围，提示OMO对痴呆模型大鼠胆碱能系统有影响，见表3。

4 讨论

相关研究显示在痴呆症患者出现神经元及病理变化的极早期，在易感神经元中就有氧化损伤出现[8]，说明氧化损伤是导致疾病的一个早期因素，很多氧化应激标志物在神经缠结还未形成之前就已经可以检测到。这就提示早期的抗氧化措施对延缓老年痴呆症发生可能会有一定帮助。本实验结果显示Aβ2535损伤模型大鼠组 SOD，CAT和GSHPx活力明显降低，MDA含量明显升高，OMO给药组SOD，CAT和 GSHPx活力明显升高，MDA含量明显降低，表明OMO能提高 AD模型大鼠脑组织中 SOD，CAT和 GSHPx，降低 MDA含量，从而起到拮抗自由基损伤防治 AD的作用。

阿尔茨海默病（AD）患者其胆碱能神经元系统有特异性神经递质缺陷，胆碱能神经元明显受损，特别是皮质和海马、前脑Meynert基底核和隔区等部位，这些脑区的乙酰胆碱基转移酶（CHAT）和乙酰胆碱酯酶（AChE）活性降低，胆碱能系统活性下降，引起脑中乙酰胆碱（ACh）浓度减少[9]。胆碱能系统改变与AD的认知功能损害程度密切相关，即“胆碱能假说”。研究发现记忆障碍以及情感异常也与不同脑区胆碱能功能障碍以及胆碱能受体数目减少有关[10]，提示胆碱能神经传导在多种高级脑功能包括学习记忆过程中起重要作用。本实验结果可以看出，OMO通过抑制痴呆模型大鼠乙酰胆碱酯酶的异常合成或释放，增加乙酰胆碱含量，以纠正胆碱能系统功能紊乱，从而达到减缓记忆衰退或提高记忆的目的。

研究证实AD病人的脑部存在多种能量代谢缺陷，AD病人的皮肤纤维细胞葡萄糖的氧化率降低，脑组织中丙酮酸盐脱氢酶复合体和α酮戊二酸脱氢酶复合体（KGDHC）活性降低[1112]。本实验结果表明，OMO具有显著提高Aβ拟痴呆模型大鼠脑组织中Na+/K+ATP含量，提示OMO具有激活痴呆模型大鼠脑能量代谢的作用，从而达到缓解痴呆对脑造成能量代谢不足。

本研究结果在前期研究基础上，进一步阐明了巴戟天低聚糖通过提高抗氧化能力、激活脑能量代谢、改善胆碱能系统损伤等来改善Aβ2535致大鼠痴呆症状。中医“肾藏精，主骨生髓，通脑”，即补肾以健腦，课题组长期对巴戟天的研究推测：补肾要药巴戟天中的低聚糖应具有显著的益脑作用，应是巴戟天补肾壮阳的物质基础[3，7]，本实验结果可为这一推测提供依据，但其具体作用生物机制有待进一步研究阐明。

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Protective effect of oligosaccharides from Morinda officinalis on

βamyloidinduced dementia rats

CHEN Diling1， ZHANG Peng2， LIN Li2*， ZHANG Heming1， LIU Songhao1

（1. Pharmaceutical Research Institute， South China Normal University， Guangzhou 510631， China；

2. College of Chinese Materia Medica， Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine， Guangzhou 510006， China）

[Abstract] Objective： To observe the effect of oligosaccharides of Morinda officinalis （OMO） on βamyloidinduced dementia rats， and study its pharmacological mechanism in treatment of dementia. Method： The dementia model rats were established by injecting Aβ2535 10 μg into bilateral hippocampus. OMO highdose （60 mg·kg-1·d-1） group， OMO lowdose （20 mg·kg-1·d-1） groups， the blank group， the sham operation group and the positive donepezil HCl group （0.125 mg·kg-1·d-1） were designed for the experiment. They were continuously administered with drugs at the 15th day after operation for 25 days. Kit microplate method was used to detect the contents of super oxide dismutase （SOD）， malondialdehyde （MDA）， catalase （CAT）， glutathione reductase （GSHPx）， acetylcholine （ACh）， acetylcholinesterase （AChE） and Na+/K+ATPase. Result： Compared with the model group， all of administration groups showed higher SOD， CAT and GSHPx levels， and lower MDA in the brain tissues. Besides， they also showed rise in the activities of ACh and Na+/K+ATPase. Conclusion： OMO can ameliorate on βamyloidinduced dementia rats by enhancing oxidation resistance， activating brain energy metabolism and improving the injury of cholinergic system.

[Key words] oligosaccharides from Morinda officinalis； dementia； pharmacodynamics； mechanism； oxidative stress； energy metabolism

doi：10.4268/cjcmm20130908

[責任编辑 张宁宁]