沙漠小球藻转植物表达载体的表达预测

材料。而基因工程也是研究热点之一，目前的转基因技术有鸟枪法[4]﹑根癌农杆菌介导法[5]和电转化法[6]。由于电转化法有效率较高、简单、方便、成本低等特点，在微藻遗传转化过程中也被广泛使用。

启动子是外源基因是否表达的关键，这决定着基因表达与否及其表达量，所以在小球藻基因工程的研究中也起着至关重要的作用。目前，CaMV35S 是基因工程中常用的启动子之一。CaMV35S 是一种花椰菜花叶病毒启动子，能够在植物表达系统中启动基因的表达[7]，也有研究表明CaMV35S可以在小球藻表达外源基因[5，8]。

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP） 是由238个氨基酸组成的多肽链，分子量约为27 ku，基因编码序列约 750 bp。纯化的GFP蛋白与体内表达的GFP蛋白的发光光谱相似，在蓝光或紫外光激发下，无论其表达在原核或真核细胞中，都能利用荧光显微镜在不需要其他辅助条件下看见绿色荧光。绿色荧光蛋白还具有低毒性和不干扰细胞正常生活等优点，使得GFP在生物研究领域中得到广泛应用。目前GFP已在转基因领域、基因表达的蛋白质定位、细胞定位以及药物的筛选等诸多方面得到广泛应用[9]。

本试验将利用GFP的特点和已经构建好的重组植物表达载体pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS，通过电击转化法导入到细胞中，让其表达绿色荧光。这将为在小球藻中表达外源蛋白和利用GFP研究其生理及理化性质提供试验的基本操作和基础；同时也为表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS在小球藻中的表达做1个预测。

1材料与方法

1.1材料

小球藻GTD8A1由笔者所在实验室分离、纯化和鉴定得到；植物表达载体PCAMBIA2300-35S-GFP-OCS （带有CaMV35S调控下的GFP基因）由石河子大学生命科学学院黄先忠老师馈赠；大肠杆菌DH5α菌株为笔者所在实验室保存；卡那霉素（kanamycin，Kan）购自北京索莱宝科技有限公司。

小球藻GT8A1所用的BBM培养基[10]：NaNO3 250 mg/L，KH2PO4 175 mg/L，K2HPO4 75 mg/L，MgSO4·7H2O 75 mg/L，CaCl2·2H2O 25 mg/L，NaCl 25 mg/L，EDTA 50 mg/L，KOH 31 mg/L，FeSO4·7H2O 4.98 mg/L，H3PO4 11.42 mg/L，ZnSO4·[JP3]7H2O 8.82 mg/L，MnCl2 1.44 mg/L，MoO3 0.71 mg/L[JP]，CaSO4·5H2O 1.57 mg/L，Co（NO3）2·6H2O 0.49 mg/L，98% H2SO4 2 μL/L（可以在以上组中加入15～20 g琼脂，加入蒸馏水补至1 L制成固体培养基，121 ℃灭菌20 min，4 ℃保存）。

E.coli DH5α所用的LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L（加去离子水溶解至终体积1 L，用2 mol/L NaOH调pH值范围为7.0～7.4，同时加入15～20 g 琼脂粉，制成固体培养基；在121 ℃高压下灭菌20 min，4 ℃ 保存）。

1.2方法

1.2.1藻种培养及其条件取对数生长末期的小球藻培养液，按10%的接种量接入装有100 mL BBM培养基的250 mL锥形瓶中，置于光照培养箱中静止培养，培养条件为：光照强度为100 μmol/（m2·s），光暗周期12 h/12 h，培养温度（23±0.5） ℃。

转化子克隆的筛选：将转化好的小球藻GT8A1涂布于含有100 mg/L卡那霉素[1]的BBM固体平板上，4～5周会有单克隆长出。然后进行菌落PCR检测，得到阳性克隆。

阳性克隆的扩大培养：将阳性克隆接入到含有15 mg/L卡那霉素的BBM液体培养基中，进行逐级扩大培养。

1.2.2提取pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS和GFP引物设计GFP基因引物设计：从NCBI上得到GFP蛋白的序列，通过Primer 5 软件从头开始设计GFP基因引物，使其能完全地表达GFP蛋白。引物序列如下：GFP-F：5′-ATGATGGTGAGCAAG-3′；GFP-R：5′-TGTACAGCTCGTCCATG-3′。

pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS载体也由黄先忠老师实验室构建完成，并且成功地在拟南芥中表达[11]。也将其保存到E.coli DH5α中，在做电击转化之前需要将E.coli DH5α进行菌落PCR检测后，才能进行扩大培养。然后采用质粒提取试剂盒（TIANGEN Plasmid Kit）进行提取，其过程见图1。

[FK（W19][TPWWL1.tif][FK）]

PCR反应体系：ddH2O 8 μL，单克隆变性液2 μL，引物（GFP-F/GFP-R）2 μL，2×Taq PCR MasterMix（TaKaRa，China） 8 μL共20 μL扩增体系，可以扩增出约750 bp的片段。

PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环30次；72 ℃ 10 min。PCR产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3电击转化法取培养4 d后的小球藻细胞3～5 mL（细胞数量控制在1×108个/mL），75 000 g离心 5 min 收集小球藻细胞后再用无菌的BBM培养基清洗3次培养基，然后分别在5 000、4 000、3 000 g下离心以收集比较干净的小球藻细胞；将收集好的小球藻细胞置于高渗溶液中（甘露醇、山梨醇各100 μL）在冰上处理约1 h，后3 000 g离心收集比较干净的小球藻细胞，去掉上清，在沉淀中加入pH值为7.2的HEPS电击缓冲液[取23.8 g HEPES溶于 90 mL 双蒸水中，采用2 mol/L的NaOH溶液调pH值至7.5～8.0，然后用蒸馏水定容至100 mL，过滤除菌，分装小瓶（2 mL/瓶），4 ℃保存]，将藻细胞稀释成1×108个/mL放置冰上备用；用紫外光处理干净的电击杯约30 min，将其放置在冰上备用；按藻细胞 ∶[KG-*3]质粒=3 ∶[KG-*3]1的比例混匀样本加入到电击杯中，在冰上放置10 min后，在电击仪上电击，电击条件为脉冲电压1 500 V，持续时间0.2 s，脉冲距离2 mm；电击后的藻细胞置于含有 3 mL 复活培养基的6孔板中，在黑暗的条件下复活24～48 h；7 000 g离心1 min收集转化小球藻细胞，再用无菌的BBM培养基清洗3次，然后分别5 000、4 000、3 000 g下离心收集比较干净的小球藻细胞涂布于含有100 mg/L卡那霉素的BBM固体平板上，筛选单克隆。培养4～6周后会有单克隆长出，然后将平板上所长的单克隆用无菌的牙签挑起后置于10 μL的ddH2O中，95 ℃预变性后作为PCR反应的模板，用PCR检测阳性克隆。

PCR反应体系：ddH2O 8 μL，单克隆变性液2 μL，引物（GFP-F/GFP-R）2 μL，2×Taq PCR MasterMix（TaKaRa，China） 8 μL共20 μL扩增体系，可以扩增出约750 bp的片段。

PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环30次；72 ℃ 10 min。 PCR产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4基因组DNA和总RNA的提取及目的基因检测基因组DNA的提取：采用DNA提取试剂盒（TIANGEN Plant Genomic DNA Kit）提取，按照说明书进行提取。

总RNA的提取：采用TRIzol试剂（Invitrogen USA）进行提取，按照说明书进行提取。

总RNA采用TaKaNa的反转录试剂盒反转成cDNA后，和总DNA一样采用PCR检测目的基因。

PCR反应体系：ddH2O 8 μL，单克隆变性液 2 μL，引物（GFP-F/GFP-R）2 μL，2×Taq PCR MasterMix（TaKaRa，China）8 μL共20 μL扩增体系，可以扩增出约750 bp的片段。

PCR反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环30次；72 ℃ 10 min。PCR产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5绿色荧光蛋白的SDS-PAGE和荧光检测经过基因组DNA和总RNA的检测后。将阳性克隆扩大培养，取 10～15 mL的培养藻液75 000 g离心2 min收集转化子的小球藻细胞后，用无菌的ddH2O清洗3次，然后利用梯度离心法：分别再5 000、4 000、3 000 g离心5 min后收集到转化子小球藻细胞，采用蛋白试剂盒提取（Plant Protein Extraction Kit）提取GFP蛋白，提取过程按说明书进行。将提取到的蛋白进行SDS-PAGE检测；然后采用荧光倒置显微镜（北京斯内克创新科技有限公司）进行荧光检测。操作过程按说明书进行，检测GFP蛋白的表达情况。

2结果与分析

2.1提取pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS和菌落PCR检测

通过菌落PCR检测含有pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS载体的E.coli DH5α菌株，将含有阳性克隆的重组植物表达载体pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS的E.coli DH5α进行扩大培养，提取质粒并用于后续试验，过程和结果见图1、2。

2.2单克隆PCR检测

通过涂布筛选得到的单克隆藻细胞，菌落PCR检测结果（图3）表明，重组质粒载体pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS可能转化进入到小球藻细胞中。

2.3基因组DNA和总RNA的提取以及PCR鉴定

经过DNA提取试剂盒（TIANGEN Plant Genomic DNA Kit）提取的总基因组DNA，通过PCR检测750 bp的GFP基因片段。总基因组DNA检测结果见图4。结果表明GFP基因整合在小球藻基因组中。

经过TRIzol试剂（Invitrogen USA）提取总RNA，结果见图5-A。然后通过RT-PCR反转录出cDNA作为模板，通过PCR检测750 bp的GFP基因片段，结果见图5-B，通过结果预测GFP基因整合在小球藻基因组中，同时GFP基因也在小球藻细胞中转录成功。

2.4绿色荧光蛋白的SDS-PAGE和荧光检测

通过植物蛋白提取试剂盒对GFP蛋白提取后，用SDS-PAGE进行检测，结果见图6。然后将通过梯度离心获得的转化小球藻细胞，在绿色荧光倒置显微镜下观察其表达结果（图7）。结果表明GFP蛋白成功表达于小球藻中。说明植物表达载体pCAMBIA2300-35S可以在小球藻中表达外源蛋白，同时也可以做小球藻生理生化的研究载体。

3讨论

我们都知道绿色荧光蛋白在植物和动物细胞表达成功的例子不胜枚举，但是在微藻中的研究少之又少。近年，随着微藻优势及其有关基因组基因测序[12]开发而来，国内外对此的研究也越来越热。从国外的研究进展来看，有研究表明GFP蛋白在莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）细胞中成功表达[13-14]。可以看到国外多是以莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）作为模式生物来研究外源基因的表达系统；因此，在国内Jiang等研究者以小球藻为模式生物来研究其外源基因的表达系统，并且和莱茵衣藻进行了表达的相关比较得知，小球藻表达外源基因系统优于莱茵衣藻[15]。与此同时，Song等利用相关的技术和pAnFP为表达载体，在鱼腥藻（Anabeana）中成功表达了绿色荧光蛋白，并通过荧光倒置显微镜观察到了绿色荧光[16]。

同样，Guo等利用相似的转基因技术和pCAMBIA1302为载体，在斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）细胞中成功表达了绿色荧光蛋白[17]。由于GFP易于标记和辨认，这使得使用GFP来研究表达系统及其生理生化也越来越重要。然而通过上面的讨论，知道不同宿主需要不同的表达载体。提示在进行基因工程的遗传转化研究时，特别是表达一些药用外源蛋白时，进行表达载体的表达筛选也显得尤为重要，这将确定最佳的表达载体以及减少不必要的浪费。

目前，有关绿色荧光蛋白（GFP）在小球藻中表达还未见报道。在本研究中，利用电转化的方法将重组植物表达载体pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS导入到小球藻中，通过基因组DNA和总RNA的理论分析和预测，得知绿色荧光蛋白基因可能整合在小球藻基因组中，并且进行了反转录。然后再通过荧光倒置显微镜证实了GFP成功地表达于小球藻中，从而验证植物表达载体pCAMBIA2300-35S能够用于小球藻中表达外源蛋白基因，这对于小球藻这种低等植物来说，将来可以利用此载体来研究小球藻的生理生化性质和表达外源蛋白，这也为小球藻利用基因工程商业化和工业化提供基础材料，同时也为沙漠环境上的开发和利用提供基础技术。

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