大鼠结缔组织生长因子siRNA荧光逆转录病毒表达载体的构建

摘要：目的 构建针对大鼠结缔组织生长因子（connective tissue growth factor ，CTGF） 的小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）荧光逆转录病毒表达载体。方法 将体外合成的两对各段含65碱基的寡核苷酸连接到pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体，构建重组质粒，同时设立非特异对照。结果 酶切、DNA 序列鉴定均证实插入片段的正确性。结论 成功地构建了鼠CTGF-siRNA荧光逆转录病毒表达载体。为进一步研究其对体内外抗纤维化作用打下基础。

关键词：CTGF； siRNA；荧光逆转录病毒表达载体

RNA干扰（RNA in terference， RNA i）是抑制目标基因的强有力的手段，人工合成的19-21核苷酸的干扰RNA在哺乳动物中能够诱导序列专一性的RNA干扰作用，已经在哺乳动物RNA干扰的分子机制方面铺平了道路[1]。大量研究证明， 结缔组织生长因子（CTGF） 是组织器官纤维化的关键和共同因子，可介导血管内皮生长因子、转化生长因子-β等多种信号刺激的纤维化效应，以CTGF为特异性靶标将给器官纤维化治疗开创新纪元[2]。本研究通过设计针对大鼠CTGFmRNA的序列，构建能够表达siRNA 的荧光逆转录病毒载体，旨在为进一步应用CTGF siRNAs抗纤维化研究创造条件。

1 资料与方法

1.1一般资料 pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体及JM109大肠杆菌菌种由中南大学湘雅医学院医学遗传国家重点实验室提供， siRNA序列及引物由大连宝生生物公司合成。

1.2方法

1.2.1 siRNA作用靶序列的选择 按照siRNA作用靶序列的设计要求[3]，从大鼠CTGF基因最完整的编码序列（序列号AF120275） 中设计4对序列分别为： T1序列为： 5′AgCTgACCTAgAggAAAAC，T2序列为： 5′AAgACACATTTggCCCTgA，T3序列为： 5′gTTCTAAgACCTgTgggAT，T4序列为： 5′CAggAAgATgTATggAgAC，阴性对照：CAgACAACTATgTACgTCg。经过BLAST[4]， 与同种属的其它基因无同源性。

1.2.2.1退火 将正义和反义两条链以100μM浓度1：1混合在PCR仪上95℃30s，72°C 2min，37°C for 2min，25°C for 2min。 行6%聚丙稀酰胺凝胶电泳，180V、30min，银染后观察退火是否成功。

1.2.2.2连接 pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体用EcorI、BamHI双酶切完全后，跑胶，经过纯化后退火，加入10ulT4连接酶体系，在16℃水浴中连接12～16h。

1.2.2转化（按分子克隆实验指南进行） 按常规操作方法连接并将重组载体转化感受态细胞JM 109 后提取质粒。

1.2.3酶切、测序鉴定 由于插入片段设计使连接后载体上形成新的酶切位点（MluI），选择能被MluI单酶切的克隆，扩大培养后抽提质粒送测序。测序引物序列为Forward Sequencing Primer： 5"-ATGATCATACTTACCGTAACGTTG-3"。测序由上海英骏生物技术有限公司完成。

2 结果

2.1酶切鉴定 连接后载体用MluI单酶切后行1%琼脂糖凝胶电泳，显示T1、 T2、T3、T4、T5组克隆出现大小约6.5kb的线形化条带， 而阴性对照组为空质粒pRZ。阳性质粒分别命名为： pRZT1、 pRZT2、pRZT3、 pRZT4 、 pRZT5 ，见图1（Fig 1）。

1： pRZT1； 2： pRZT2； 3： pRZT3； 4： pRZT4 ； 5： pRZT5 6： pRZ M： DNA/ Hind Ⅲ Marker

Fig1 Enzyme digestion analysis of pRZ-siRNA expression vectors

图1 pRZ-siRNA重组质粒酶切鉴定

2.2测序结果 CTGF-siRNA逆转录病毒荧光载体测序结果经DNAstar软件与标准序列进行拼接后显示，连入序列正确，无突变。见图2。

图2 pRZ-siRNA重组质粒测序拼接图

3 讨论

随着人类基因治疗技术的迅速发展，越来越多基因治疗方案进入临床试验，以逆转录病毒作为介导载体也是目前基础和临床研究中最常用的基因转染方法。能在哺乳类细胞中直接表达siRNA 的质粒载体系统的发明和改进[5]，使基于载体表达的方法制备siRNA最为优越。质粒、病毒类载体介导的siRNA表达方法的出现，克服了化学合成与体外转录方法时siRNA进入细胞后容易被降解，进入细胞siRNA在细胞内的RNAi效应持续时间短等缺点。由于质粒可以复制扩增，相比起其它合成方法来说，这就能够显著降低制备siRNA的成本[6]。

我们选择带有ZsGreen熒光标记的缺陷型逆转录病毒载体pSIREN- RetroQ-ZsGreen，将大鼠CTGF-siRNA克隆至该载体，进行病毒包装并筛选具有高滴度感染性重组病毒产生细胞系的研究。我们所采用的逆转录病毒表达系统整合，大大提高siRNA表达载体对宿主细胞的侵染性，彻底克服某些细胞转染效率低的障碍。我们通过荧光标记很容易观察到载体的转染效率及目的基因的沉默效率。本研究针对大鼠CTGF基因构建siRNA 的荧光逆转录病毒载体，以期持续稳定地抑制该基因的表达，为延缓器官纤维化的基因治疗提供一种可能途径。

参考文献：

[1]Elbashir SM， Harborth J， Lendeckel W， et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells[J]. Nature，2001，411：494-498.

[2]Rachfal， A.W.， and Brigstock， D.R. Connective tissue growthfactor （CTGF/CCN2） in hepatic fibrosis[J]. Hepatol Res，2003 26： 1-9.

[3]http：//bioinfo2.clontech.com/rnaidesigner/

[4]http： //.cn/qkpdf/yxxi/yxxi201412/yxxi201412627.pdf" style="color:red" target="_blank">原版全文 推荐访问： 逆转录 结缔组织 荧光 载体 大鼠