三种鸭防御素真核表达载体的构建及其表达分析

报告基因EGFP（增强型绿荧光蛋白）已表达。

2.4 重组蛋白的Western-blot鉴定

转染重组表达质粒的293细胞经Western-blot鉴定，结果表明，3种鸭AvBDs重组质粒转染细胞均无明显的表达带，PBD1表达带和β-actin表达带明显，结果见图4，这表明3种鸭防御素未能在293细胞中表达或其表达量极低。

3 讨论

禽类防御素是禽类天然免疫系统的一部分，在抵御病原微生物的侵袭中发挥着重要作用[3]。研究表明，禽类防御素对大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌和某些病毒具有抑制作用[4]。人们对禽类防御素的分子结构、生物学特性、抗微生物机理和应用正进行着越来越深入的研究。由于禽类防御素天然产量低，从机体中提取天然产物的过程复杂且产量低，这使得从人工表达及转基因植物表达等方面对禽类防御素进行研究成为重点。目前，已报道有鸡防御素[5]、鸭防御素[6]、鹅防御素[7]、鹌鹑防御素[8]等禽类防御素获得了表达。然而，这些研究多是利用大肠杆菌或酵母菌等为表达系统。关于禽类防御素在动物细胞中的表达很少报道。动物细胞是否适合表达禽类防御素还有待研究。2010年，侯淑倩[9]报道了鸡β-防御素-5在COS7细胞中的表达，但仅从mRNA水平检测了防御素的表达情况；2011年，单艳菊等[10]利用Flp-In-293细胞表达鸡β-防御素-1，也未从蛋白质水平对表达蛋白进行验证。本研究构建了表达鸭防御素AvBD2、AvBD10和AvBD12的真核表达载体，并在动物细胞HEK293中对这3种防御素进行了表达。通过检测这3种防御素的mRNA，证实外源防御素基因成功转录，然而用Western-blot并没有检测到相应的蛋白质。这可能暗示用动物细胞大量表达禽类防御素存在一些尚待解决的技术问题。

本研究中的禽类防御素未能大量表达的原因可能有3方面：①禽类防御素分子为碱性小肽，易被蛋白酶降解[11]。目前，大部分研究采用融合表达或串联表达的方法来表达防御素。这些表达方法可以人为增大表达蛋白的分子质量，并使其更容易形成包涵体，从而达到保护表达蛋白不被蛋白酶降解的目的。本研究为了保证防御素分子的高仿真性，只在目的蛋白的末端融合了flag标签（共8个氨基酸），对分子量的改变较小。②外源基因在转录后可能发生基因沉默[12]，这是外源基因在表达过程中时常发生的现象。由于本研究中检测到了3种禽类防御素的mRNA，但未检出目的蛋白，因此推测可能发生了转录后基因沉默。宿主细胞中的一些RNA分子，比如细胞自身转录的某些防御素mRNA，可能对鸭防御素的mRNA造成了干扰，导致无法正常翻译。③外源的禽類防御素可能对宿主细胞HEK293产生毒性作用，导致无法正常表达。已证实防御素对某些动物细胞具有一定的毒性作用，例如人β-防御素2对口腔癌KB细胞具有抑制作用[13]。

本研究构建了3种鸭防御素的真核表达载体，将其转染HEK293细胞行表达，并从RNA水平和蛋白质水平对目的基因的表达情况进行了检测。虽然表达未能成功，但为今后禽类防御素的表达研究提供了参考。

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