响应面法优化促植物生长枯草芽孢杆菌CK15产芽孢条件

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1.1 材料

1.1.1 供试菌种。枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis CK15，由广西大学生命科学与技术学院保存。

1.1.2 试验材料与试剂。糖蜜、木薯淀粉、麸皮、玉米粉、豆粕粉、玉米浆干粉、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、蛋白胨、尿素、硫酸铵、CaCO3、MgSO4、MnSO4、NaCl、KH2PO4、CaCl2、CuCl2均为国产分析纯。

1.1.3 培养基。种子培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L。碳源基础培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L。氮源基础培养基：葡萄糖 5 g/L，NaCl 5 g/L。无机盐基础培养基：葡萄糖 5 g/L，胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化。取斜面保藏菌种划线至平板上，28 ℃恒温倒置培养1 d。

1.2.2 种子培养。用接种环从活化好的平板上刮取菌株，接种至装有100 mL LB培养基的250 mL三角瓶中，在摇床上28 ℃、180 r/min培养12 h至对数期。

1.2.3 发酵培养。按2%的量接种至装有100 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，在摇床上28 ℃、180 r/min培养48 h。

1.2.4 芽孢检测。取1 mL发酵液至EP管中，置于80 ℃恒温水浴锅中20 min，取出EP管冷却至室温，取0.1 mL发酵液至装有0.9 mL无菌水的EP管中，用移液枪吹打混合均匀，然后再取0.1 mL稀释好的发酵液0.1 mL至另一管装有0.9 mL无菌水的EP管中，用移液枪吹打混合均匀，依次稀释至合适浓度，取0.1 mL稀释好的发酵液涂平板。将平板置于28 ℃恒温培养箱培养24 h，计数平板上的菌落数[14]。

1.2.5 单因素试验。研究碳源种类（蔗糖、糖蜜、可溶性淀粉、木薯淀粉、麸皮、葡萄糖、玉米粉）及筛选出的最佳碳源浓度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）、氮源种类（豆粕粉、玉米浆干粉、蛋白胨、尿素、硫酸铵）及筛选出的最佳氮源浓度（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）、无机盐种类（CaCO3、MgSO4、MnSO4、NaCl、KH2PO4、CaCl2、CuCl2）、装液量（50、75、100、125、150 mL）、摇床转速（140、160、180、200、220 r/min）、初始pH（6.8、7.0、7.2、7.4、7.6）、发酵温度（26、28、30、32、34 ℃）、接种量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）对芽孢产量的影响。

1.2.6 Plackett-Burman试验。在单因素试验的基础上，以芽孢量（cfu/mL）为响应值，选择A（玉米粉）、B（豆粕粉）、D（KH2PO4）、E（CaCO3）、G（NaCl）、H（MnSO4）6个因素进行Plackett-Burman试验，另设3个虚拟项作为误差分析，每个因素取高（+1）、低（-1）2个水平。用minitab.V17.1.0软件考察各个因素对芽孢产量的重要性，试验设计见表1。

1.2.7 最陡爬坡试验。以Plackett-Burman 试验筛选出的显著因素，用单因素试验结果设计步长，因素为正效应步长递增，负效应步长递减。其他因素取单因素最佳水平，进行最陡爬坡试验，接近芽孢产量最大值区域。

1.2.8 Box-Behnken 试验。Box-Behnken 法可用于 2～5 个因素的优化试验，每个因素取 3 个水平。根据试验表得到结果后，对数据进行二次回归拟合，得到带交互项和平方项的二次多项回归模型，对该模型进行方差和回归分析，在一定水平范围内得到芽孢产量的最佳值。用筛选出的影响芽孢产量最显著的3个因素进行三水平的中心组设计。根据Plackett-Burman试验得到的数据结果，对预测模型斜率是正值的因素，适当提高其水平，斜率是负值的因素，适当降低其水平，不显著的单因素取单因素试验最佳值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

由图1可知，以玉米粉为碳源，浓度为1%时芽孢产量最高；豆粕粉浓度为2%时，芽孢产量最高；过高过低的C/N都不利于芽孢的积累；CaCO3、MnSO4、KH2PO4、NaCl对芽孢产量影响显著；装液量为在50 mL、转速为220 r/min时，芽孢产量最高，但与200 r/min时相比芽孢产量增幅不大，所以选择200 r/min为最佳转速；芽孢产量先增后减，当pH为7.2、温度为30 ℃、接种量为2%时芽孢产量最高。单因素试验只考虑各因素的最优值，未考虑因素之间相互作用，所得发酵条件未必为最优条件。

2.2 Plackett-Burman 试验结果

由表2可知，整个模型显著，A（玉米粉）、B（豆粕粉）、D（KH2PO4）、E（CaCO3）、H（MnSO4）5个因素影响显著。由p-value值可知，影响重要性大小依次为B（豆粕粉）、A（玉米粉）、E（CaCO3）、D（KH2PO4）、H（MnSO4），选取前3个影响较大因素进一步试验。

2.3 最陡爬坡试验结果

根据Plackett-Burman试验结果，以芽孢产量的梯度方向为爬坡方向，根据T值可知各因素对芽孢产量的影响，玉米粉为负效应，豆粕粉和CaCO3为正效应，其余3个因素均取最低水平。由表3可知，第2组试验芽孢产量最高，说明最优点在第2组试验附近。选择第2组为响应面中心点，即玉米粉10.5 g/L、豆粕粉24.0 g/L、CaCO3 7.5 g/L，进一步试验。

2.4 响应面试验结果

由最陡爬坡试验结果所得中心点，运用minitab.V17.1.0创建Box-Benhnken进行响应面分析，试验设计及结果见表4。

运行minitab.V17.1.0软件对响应者进行多元回归拟合并进行方差分析。结果表明，该模型决定系数R2=0.989 4>0.9，校正决定系数R2Adj=0.970 3，说明响应面97.03%的变化可由该模型解释，表明该模型拟合度良好。

以芽孢产量（Y）为响应值，各试验因素对响应值的影响可用下列函数表示：

Y= -880.5 + 45.2X1+21.20X2+104.35X3-2.900X21-0.588 9X22- 5.900X23+0.933X1X2-0.800X1X3-0.333X2X3

芽孢产量（Y）响应值最大时的各因素水平为：X1=10.697 0，X2=24.378 8，X3=7.434 3，此时芽孢产量预测值为7.638 1×109 cfu/mL。

发酵最优条件为：玉米粉10.7 g/L，豆粕粉24.4 g/L，CaCO3 7.4 g/L，NaCl 5.0 g/L，MnSO4 0.4 g/L，KH2PO4 1.0 g/L，装液量50 mL/250 mL，转速200 r/min，初始pH 7.2，温度30 ℃，接种量2.0%。在上述条件下对试验结果进行预测和分析。优化发酵条件试验结果表明，发酵条件优化后的芽孢产量比优化前大大提高（表5）。

运用minitab.V17.1.0软件可得到3个重要因子之间的响应面曲面图及其等高线图。等高线的形状反映因子交互作用的强弱，椭圆表示交互作用显著，圆形表示交互作用不显著。

由图2可知，CaCO3浓度一定时，随着玉米粉和豆粕粉的不断增加，芽孢产量开始不断提高，后期小幅度下降。一定程度上增加玉米粉有利于芽孢产生，但过多的玉米粉导致C/N过高，不利于芽孢产量的提高。

由图3可知，当豆粕粉一定时，芽孢产量随玉米粉和CaCO3的不断增加而先增加后减少，说明碳源的过高或过低都不利于芽孢的积累。CaCO3对芽孢产量影响较显著，表现为较陡的曲面，玉米粉对芽孢产量的影响较小，曲面平滑。

由图4可知，豆粕粉与CaCO3的交互作用影响小于玉米粉与CaCO3。在玉米粉一定时，随着豆粕粉和CaCO3的不断增加，芽孢产量呈现开始上升，到达最高点后下降。豆粕粉和CaCO3对芽孢产量都有较大影响，合适的豆粕粉和CaCO3浓度有利于芽孢的积累。

2.5 模型的验证

综合响应面结果分析，应用minitab.V17.1.0软件分析得出芽孢产量的最佳发酵条件为X1=10.697 0，X2=24.378 8，X3=7.434 3，此时芽孢产量预测值为7.638 1×109 cfu/mL。采用上诉最优条件进行试验，得到芽孢产量为7.4×109 cfu/mL与预测值7.638 1×109 cfu/mL接近，表明该模型能较好地预测实际芽孢产量情况。

3 结论

在单因素试验的基础上，应用Plackett-Burman试验从众多因素中筛选出显著因素分别为玉米粉、豆粕粉、CaCO3。用爬坡试验靠近最大值范围，通过Box-Behnken试验得到显著因素的最佳水平，最终得出最佳发酵条件为：玉米粉10.7 g/L、豆粕粉24.4 g/L、CaCO3 7.4 g/L、NaCl 5.0 g/L、MnSO4 0.4 g/L、KH2PO4 1.0 g/L、装液量50 mL/250 mL、转速为200 r/min、初始pH 7.2、温度30 ℃、接种量2.0%。实际得到芽孢产量为7.4×109 cfu/mL，比优化前提高了80.49%，与预测值接近，表明预测模型可用于实际生产中。

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