错配修复/微卫星不稳定性对晚期结直肠癌化疗敏感性及预后的影响

方案化疗的181例晚期结直肠癌患者的原发肿瘤组织，采用免疫组化方法检测肿瘤组织MLH1、PMS2、MSH2、MSH6 4种蛋白的表达情况，并分为MSI组（18例）和微卫星稳定组（MSS组，163例），比较两组在化疗敏感性和预后中的差异。 结果 除了病变部位外（P < 0.05），其他临床特征在MSI组及MSS组中差异均无统计学意义（P > 0.05）。采用Kaplan-Meier生存曲线对随访资料进行分析，MSI组和MSS组的患者总体生存时间差异无统计学意义（P > 0.05）。化疗敏感性方面，MSI组和MSS组的化疗总有效率差异无统计学意义（P > 0.05），但是MSI组疾病控制率显著高于MSS组，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 MSI状态与晚期结直肠癌患者的总生存时间无关，与疾病控制率有关。因此，MSI可以作为评估晚期结直肠癌患者化疗效果的重要指标。

[关键词] 错配修复/微卫星不稳定性;结直肠癌;化疗敏感性;预后

[中图分类号] R735.3          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）03（b）-0108-05

结直肠癌是人类常见的恶性肿瘤，近年来其发病率和死亡率在世界范围内显著升高[1]。我国也不例外，结直肠癌的发病率增幅远超其他消化道恶性肿瘤[2]。目前，结直肠癌临床治疗主要包括手术治疗、化学治疗及放射治疗。其中，手术治疗是最主要的治疗手段，但是术后仍有近一半的患者发生局部复发或者远处转移。错配修复（mismatch repair，MMR）基因是修复DNA双螺旋结构错误过程中的关键基因，其缺失状态称为dMMR（mismatch repair defective），而无缺失状态称为pMMR（mismatch repair proficient）[3]。MMR缺陷可导致DNA复制后自我修复功能丧失，产生微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI），而没有位点发生微卫星不稳定现象则称为微卫星稳定（microsatellite stability，MSS）。目前认为，MMR基因主要包括MSH2、MLH1、MSH3、MSH6、PMS1和PMS2，任何一项错配修复基因表达缺失都可以导致MSI[4]。由于MSI在结直肠癌发生发展过程中发挥着重要作用，许多学者对其临床意义进行相关研究，但是仍存在较大分歧[5-6]。为此，本研究回顾性分析181例晚期结直肠癌患者MMR/MSI状态对患者生存和化疗敏感性的影响，进一步明确其在判断预后及化疗效果中的实际价值，为其更精准地应用于临床提供重要理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2009年12月～2016年12月于扬州大学附属医院肿瘤科接受治疗的晚期结直肠癌患者181例。纳入标准：①所有患者均经病理确诊为结直肠癌，且随访资料完整;②年龄18～70岁;③影像学检查或转移灶活检明确存在远处转移灶;④ECOG 0～1分或PS评分>70分;⑤有RECIST实体瘤疗效评价标准中的可测量病灶;⑥至少完成2个周期FOLFOX或XELOX方案化疗，并有疗效评估结果。排除标准：①病理诊断不明确;②存在化療禁忌证;③预计生存期 < 3个月;④患者依从性差;⑤严重心肺器质性疾病及造血系统疾病。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有患者和/或家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 化疗方案

FOLFOX方案：奥沙利铂85 mg/m2静脉滴注2 h，第1天;亚叶酸钙200 mg/m2静脉滴注2 h，第1～2天;5-氟尿嘧啶400 mg/m2静脉推注，第1～2天，接着给予5-氟尿嘧啶600 mg/m2持续静脉注射22 h，第1～2天。化疗方案每2周重复1次。

XELOX方案：奥沙利铂130 mg/m2静脉滴注2 h，第1天;卡培他滨850～1000 mg/m2口服每天2次，第1～14天。化疗方案每3周重复1次。

1.3 化疗疗效判断

根据RECIST实体瘤疗效评价标准判断完全缓解（complete remission，CR），部分缓解（partial remission，PR），稳定（stable disease，SD），进展（progressive disease，PD），CR+PR定义为为治疗有效，CR+PR+SD定义为疾病控制。总生存时间（overall survival，OS）定义为从确诊为晚期结直肠癌至任何原因导致的死亡的时间。

1.4 实验方法

1.4.1 主要实验试剂和实验仪器  小鼠抗人MLH-1单克隆抗体（生产批号：18386503）、兔抗人MSH-2单克隆抗体（生产批号：18660703）、兔抗人MSH-6单克隆抗体（生产批号：18680403）、兔抗人PMS-2单克隆抗体（生产批号：18610203）及二步法通用试剂盒（小鼠/兔超敏聚合物法检测系统）（生产批号：110167D12）均购自中国中杉金桥生物技术有限公司，组织包埋机及石蜡切片机购自美国赛默飞世尔科技有限公司，全自动组织脱水机购自英国珊顿公司，染片机、漂片机及免疫组化观察显微镜购自法国莱卡公司。

1.4.2免疫组织化学方法  肿瘤组织依次经过甲醛固定、洗涤与脱水、透明、浸蜡、包埋及切片。厚度为4～5 μm的切片经梯度酒精脱水、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶及血清封闭。切片经PBS水洗3次，按工作浓度滴加一抗后4°C孵育过夜。PBS水洗切片3次;按工作浓度滴加二抗，室温孵育50 min。切片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤后滴加二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色液，苏木精复染3 min，梯度酒精脱水和中性树胶封片。

结果判读：所有阅片均由两名具有丰富临床经验的病理科医师完成。染色结果判读依据如下：随机选取5个高倍镜视野进行观察，根据染色强度和染色面积进行评分。染色强度分为：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。染色面积分为：0分为阴性，1分为阳性细胞≤10%，2分为>10%～50%，3分为>50%～75%，4分为>75%。将上述两者相乘的结果作为最终的评定标准：0分为阴性表达，1～3分为弱阳性表达，4～7分为中度阳性表达，8～12分为强阳性表达。4种蛋白中任意一种表达为阴性则定义为MSI状态。

1.5 统计学方法

采用统计学软件SPSS 17.0对数据进行分析，计数资料用率表示，采用χ2检验。采用Kaplan-Meier生存模型构建生存曲线，两组生存曲线比较则采用时序检验（Log-rank test）。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者一般临床特征

本研究共纳入181例晚期结直肠癌患者，其中男96例，女85例;<60岁76例，≥60岁105例;肿瘤低分化者68例，中高度分化者113例;病变部位在右半（包括升结肠、横结肠、肝曲）者86例;左半（包括直肠、乙状结肠、降结肠、脾曲）者95例;单发转移者11例，多发转移者170例。除了病变部位外，其他临床特征在MSI组和MSS组差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 两组错配修复蛋白的表达情况

免疫组织化学结果显示在181例晚期结直肠癌患者的原发肿瘤组织中，18例（9.9%）判定为dMMR，即MSI;163例（90.1%）判定为dMMR，即MSS。

2.3 MSI对晚期结直肠癌患者预后的影响

Kaplan-Meier生存分析结果显示，MSI组和MSS组患者的总生存时间分布差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.4 患者化疗效果的分析

所有晚期结直肠癌患者接受FOLFOX或XELOX方案化疗。MSI组中，2例部分缓解，10例稳定，6例进展，化疗总有效率为11.1%，疾病控制率为66.7%;MSS组中，14例部分缓解，54例稳定，95例进展，化疗总有效率为8.6%，疾病控制率为41.7%，两组总有效率无统计学差异，但MSI组疾病控制率显著高于MSS组。此外，本研究中没有患者出现完全缓解。MSI组和MSS组的化疗总有效率差异无统计学意义（P > 0.05），但是MSI组疾病控制率显著高于MSS组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

3 讨论

微卫星又称短串联重复（short tandem repeat，STR）序列，是DNA基因组中小于10个核苷酸的简单重复序列，其随机分布于人类基因组的编码区和非编码区，其中位于编码区的微卫星容易出现复制滑脱[7-8]。正常生理条件下，DNA错配修复系统可以及时发现并纠正微卫星序列复制产生的错误，进而维持整个基因组的稳定;而当出现基因突变或缺失时，DNA错配修复系统不能正常修复DNA复制过程中滑动链与互补碱基出现的错配，导致一个或多个重复碱基的插入或缺失，进而引起MSI[9]。

目前主要利用两种方法检测MSI：一是通过聚合酶链反应检测样本中微卫星位点序列，并与正常DNA序列进行比对分析，进而判别MSI状态;二是通过免疫组织化学法（immunohistochemistry，IHC）检测样本中错配修复蛋白表达情况。既往结直肠癌相关研究将错配修复缺陷定义为错配修复蛋白缺失，即MSI-H，而错配修复蛋白表达完整定义为MSI-L或MSS[10-11]。IHC检测法相比于聚合酶链反应有着易操作、成本低等优势，且能够靶向识别特定蛋白缺失，因而在临床上普遍用于检测结直肠癌组织MSI[12]。本研究也采用了该方法检测晚期结直肠癌患者肿瘤组织中MSI状态。

目前，MLH-1和MSH-2为早期发现的错配修复蛋白，在结直肠癌中研究较为透彻[13-17]。此外，MLH1蛋白可以与PMS2或MSH2蛋白相形成二聚体，进而参与调控核酸内切酶活性。类似的，MSH2蛋白可与MSH6蛋白形成复合蛋白进而参与调控错配修复[18-19]。本研究中检测晚期结直肠癌患者肿瘤组织中四种代表性错配修复蛋白（MLH-1、MSH-2、MSH6以及PMS2）的表达情况，结果发现有18例（9.9%）患者存在MSI。同时，本研究还发现MSI状态与肿瘤位置显著相关，而与其他临床病理参数（如年龄、性别、病理类型以及肿瘤组织分化程度）无关（P > 0.05）。上述发现与国内学者李政[20]研究一致，他们发现基因编码差异以及蛋白表达水平不同可能與结直肠癌的发病位置存在关联。在预后分析中，本研究发现MSI状态与晚期结直肠癌患者的总体生存无显著相关性。Des Guetz等[21]通过Meta分析也得出了MSI对晚期结直肠癌患者总生存时间及化疗反应无影响的结论。国内学者吴雨辰等[22]在其最新研究中也验证了上述结论。最后，本研究在分析MSI状态对一线化疗方案（FOLFOX或XELOX）治疗效果的影响时发现其与化疗总有效率无关（P > 0.05），但MSI组疾病控制率显著高于MSS组（P < 0.05），提示MSI患者较MSS患者在接受一线化疗后存在较低的肿瘤进展风险。

尽管本研究初步明确了MSI对晚期结直肠癌患者预后及化疗效果的影响，但仍存在一定的局限性。首先，研究结果来自于单中心临床队列，具有一定的选择偏倚;其次，本研究主要关注于MLH-1、MSH-2、MSH6以及PMS2 4种蛋白，而其他错配修复蛋白（如MSH3和PMS1）是否在晚期结直癌患者中具有一定的临床意义尚未清楚。再次，由于MSI患者在总体患者中所占比例较低（18例），导致研究样本量较小，因而MSI在晚期结直肠癌中的临床预后价值仍需进一步在多中心大样本的临床研究中得以验证。最后，本研究仅限于检测错配修复蛋白在临床样本中的表达水平，后续我们将进行体内体外功能研究，进一步阐明相关分子机制。

综上所述，本研究发现MSI与晚期结直肠癌化疗敏感性密切相关，尽管这样的结果还有待在大样本人群中进行验证。除此之外，联合环境相关的因素，例如饮食因素与MSI在结直肠癌发生发展是否存在协同作用值得深入研究。随着相关研究的深入，MSI有望成为临床重要的诊断及预后指标，帮助广大结直肠癌患者改善预后，最终提高结直癌的总体生存率。

[参考文献]

[1]  Buyse M，Burzykowski T，Carroll K，et al. Progression-free survival is a surrogate for survival in advanced colorectal cancer [J]. J Clin Oncol，2007，25（33）：5218-5224.

[2]  Siegel RL，Miller KD，Fedewa SA，et al. Colorectal cancer statistics，2017 [J]. CA Cancer J Clin，2017，67（3）：177-193.

[3]  Walker M，O′Sullivan B，Perakath B，et al. Selecting patients with young-onset colorectal cancer for mismatch repair gene analysis [J]. Br J Surg，2007，94（12）：1567-1571.

[4]  Mendillo ML，Mazur DJ，Kolodner RD. Analysis of the interaction between the Saccharomyces cerevisiae MSH2-MSH6 and MLH1-PMS1 complexes with DNA using a reversible DNA end-blocking system [J]. J Biol Chem，2005， 280（23）：22245-22257.

[5]  Brueckl WM，Moesch C，Brabletz T，et al. Relationship between microsatellite instability，response and survival in palliative patients with colorectal cancer undergoing first-line chemotherapy [J]. Anticancer Res，2003，23（2C）：1773-1777.

[6]  Müller CI，Schulmann K，Reinacher-Schick A，et al. Predictive and prognostic value of microsatellite instability in patients with advanced colorectal cancer treated with a fluoropyrimidine and oxaliplatin containing first-line che-motherapy. A report of the AIO Colorectal Study Group [J]. Int J Colorectal Dis，2008，23（11）：1033-1039.

[7]  Carethers JM，Koi M，Tseng-Rogenski SS. EMAST is a Form of Microsatellite Instability That is Initiated by Inflammation and Modulates Colorectal Cancer Progression [J]. Genes （Basel），2015，6（2）：185-205.

[8]  Press MO，Carlson KD，Queitsch C. The overdue promise of short tandem repeat variation for heritability [J]. Trends Genet，2014，30（11）：504-512.

[9]  Gadgil R，Barthelemy J，Lewis T，et al. Replication stalling and DNA microsatellite instability [J]. Biophys Chem，2017， 225：38-48.

[10]  Gupta R，Sinha S，Paul RN. The impact of microsatellite stability status in colorectal cancer [J]. Curr Probl Cancer，2018，42（6）：548-559.

[11]  Nojadeh JN，Behrouz Sharif S. Microsatellite instability in colorectal cancer [J]. Excli J，2018，17：159-168.

[12]  秦云，梁莉萍，鄭兴征，等.免疫组织化学法检测结直肠癌四种 DNA错配修复蛋白表达缺失对判断肿瘤微卫星状态的价值[J].中华病理学杂志，2015， 44（10）：704-708.

[13]  Jin P，Wang DZ，Lyu CX. Mismatch repair protein hMLH1，but not hMSH2，enhances estrogen-induced apoptosis of colon cancer cells [J]. J Cancer，2017，8（16）：3232-3241.

[14]  Karahan B，Argon A，Yldrm M，et al. Relationship between MLH-1，MSH-2，PMS-2，MSH-6 expression and clinicopathological features in colorectal cancer [J]. Int J Clin Exp Pathol，2015，8（4）：4044-4053.

[15]  Takehara Y，Nagasaka T，Nyuya A，et al. Accuracy of four mononucleotide-repeat markers for the identification of DNA mismatch-repair deficiency in solid tumors [J]. J Transl Med，2018，16（1）：5.

[16]  Ozkara S，Sari B，Yesil A，et al. Evaluation of colorectal adenocarcinomas at single-institution with respect to microsatellite instability [J]. Chirurgia （Bucur），2013，108（4）：473-477.

[17]  Li G，Hu F，Yuan F，et al. Intronic and promoter polymorphisms of hMLH1/hMSH2 and colorectal cancer risk in Heilongjiang Province of China [J]. J Cancer Res Clin Oncol，2015，141（8）：1393-1404.

[18]  陳寅波，刘卓，钱俊，等.DNA错配修复基因hMLH1与hMSH2在结直肠癌合并慢性血吸虫肠病与散发型结直肠癌中表达的差异研究[J].中华胃肠外科杂志，2016，19（1）：75-79.

[19]  Matsuzaki K，Borel V，Adelman CA，et al. FANCJ suppresses microsatellite instability and lymphomagenesis independent of the Fanconi anemia pathway [J]. Genes Dev，2015，29（24）：2532-2546.

[20]  李政.错配修复蛋白在结直肠癌中的临床意义及其与BRAF～（V600E）突变相关性研究[D].石家庄：河北医科大学，2017.

[21]  Des Guetz G，Schischmanoff O，Nicolas P，et al. Does microsatellite instability predict the efficacy of adjuvant chemotherapy in colorectal cancer？ A systematic review with meta-analysis [J]. Eur J Cancer，2009，45（10）：1890-1896.

[22]  吴宇辰，张长胜，梁斐，等.微卫星不稳定状态对Ⅳ期结直肠癌患者化疗反应性和预后的影响[J].中国癌症杂志，2015，25（7）：522-528.

（收稿日期：2018-07-16  本文编辑：苏   畅）