血清miR系列基因表达水平与非小细胞肺癌预后的相关性研究

对照组。采用qRT-PCR方法检测NSCLC组和对照组中血清miR系列基因表达水平，判断血清miR系列基因表达水平与预后的关系。 结果 NSCLC组化疗3个疗程的患者的血清miR系列基因表达与化疗前存在明显差异（P<0.05）；对照组的血清miR系列基因表达与化疗前患者存在明显差异（P<0.05），与化疗后指标比较无统计学意义（P>0.05）。结论 血清miR系列基因表达水平在NSCLC患者明显升高，治疗后miR系列基因表达明显下降，血清miR系列基因有可能成为预测NSCLC预后的分子标志物。

[关键词] 非小细胞肺癌；miR系列基因；qRT-PCR法；基因表达

[中图分类号] R734.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）04-0016-03

Study on the correlation between the expression level of serum miR gene and the prognosis of non-small cell lung cancer

CHEN Qun SHI Qin

Department of Oncology， Fujian Medical University Teaching Hospital， Fuzhou Pulmonary Hospital， Fuzhou 350008， China

[Abstract] Objective To investigate the correlation between the expression level of serum miR gene and the prognosis of non-small cell lung cancer （NSCLC）. Methods Frozen tissues and serum samples from 250 patients with NSCLC from April 2010 to April 2013 were collected. The serum samples of 25 cases of NSCLC and its adjacent tissues， 25 patients with advanced NSCLC without surgery before the chemotherapy and after 3 courses treatment， and 200 patients with NSCLC without any anticancer treatment were selected as the NSCLC group. Serum samples of 100 healthy volunteers were selected as the control group. The levels of serum miR gene expression in NSCLC group and control group were detected by qRT-PCR method， and the relationship between the expression level of serum miR gene and prognosis was judged. Results The expression of serum miR gene in the patients in NSCLC group after 3 courses of chemotherapy was significantly different from that before the chemotherapy（P<0.05）； the expression of serum miR gene in the control group was significantly different from that before chemotherapy（P<0.05）， and there was no significant difference in the patients after chemotherapy（P>0.05）. Conclusion Serum miR gene expression level is significantly increased in NSCLC patients. After the treatment， the expression of miR gene is decreased significantly. The serum miR gene may become a molecular marker for predicting the prognosis of NSCLC.

[Key words] Non-small cell lung cancer； miR gene； qRT-PCR method； Gene expression

非小細胞肺癌（NSCLC）是临床上较为常见的恶性肿瘤，手术、放化疗是治疗非小细胞肺癌的主要手段，但非小细胞肺癌对术后辅助放、化疗敏感性差[1，2]。而且评价化疗后的效果，除常规指标，miR系列基因也被广泛应用作为评价NSCLC的临床疗效指标，可以反映化疗后指标的变化，从而确定化疗效果。大部分学者关于miR系列基因与NSCLC预后的研究涉及其中的几个指标，但是本研究涉及6个指标miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1，因此可以更准确地判断。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

分别收集2010年4月～2013年4月的250例NSCLC患者冰冻组织和血清样本，并按期整理临床治疗资料，25例为NSCLC及其癌旁组织，收集其手术前和手术后2周的血清样本；25例未经手术治疗的晚期NSCLC患者化疗前和3个疗程后的血清样本；200例未经任何抗癌治疗的NSCLC患者血清，作为NSCLC组；选取100例与NSCLC组年龄性别分布相同的健康志愿者的血清样本，作为对照组。两组对象在性别和年龄方面无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 RNA分离提取 按照试剂说明书，组织total RNA抽提使用The miRVana miRNA Isolation Kit（Ambion，Austin，Texas，USA）。血清的total RNA 使用microRNAs Isolation Kit（Applied Biosystems，Forster City，CA，USA）抽提。total RNA溶于DEPC处理水中，-80℃保存。RNA浓度使用Nanodrop 2100（NanoDrop，Wilmington，DE）测定。

1.2.2 qRT-PCR分析 差异表达使用Two-step qRT-PCR分析。第一步cDNA的反转录，第二步 real-time quantitative PCR。miRNA的反转录相关操作严格按试剂盒One Step Prime Script®；microRNA cDNA Synthesis Kit（Takara，Tokyo，Japan）操作说明进行，反转录的反应体系为[3，4]：2×microRNA Reaction Buffer Mix 10 μL，0.1%BSA 2 μL，microRNA Prims Script®；RT Enzyme Mix 2 μL，Total RNA 1 μL，RNase Free ddH2O 5 μL。反转录反应条件：37℃ 60 min，85℃变性5 s。microRNA的qRT-PCR严格按照试剂盒SYBR & reg；Premix EX TaqTM Ⅱ（Takara，Tokyo，Japan）操作说明进行，qRT-PCR的反应体系为SYBR®；Premix EX TaqTM Ⅱ 12.5 μL，PCR Forward Primer 1 μL，Uni-miR qPCR Primer 1 μL，模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。qRT-PCR反应条件为95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火和延伸30 s，共40个循环。定量PCR使用ABI 7900的Fast real time PCR system（Applied Biosystems，Carlsbad，CA）执行，每个样本平行重复3次，采用U6 snRNA 做参考基因，2-△△Ct method 用于计算基因表达倍数变化。

1.3 统计学方法

数据分析使用SPSS21.0 统计学软件，所有数据均符合正态分布，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，进行t检验，P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miR系列基因表达水平比较

见表1。NSCLC组化疗3个疗程患者的血清miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1基因表达与化疗前存在明显差异（P<0.05）；对照组血清miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1基因表達与化疗前患者存在明显差异（P<0.05），与化疗后患者比较无统计学意义（P>0.05）。

2.2 不同病理NSCLC患者化疗前后血清miR系列基因表达水平比较

见表2。不同病理NSCLC患者化疗后血清miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1基因表达与化疗前比较存在明显差异（P<0.05）。

3 讨论

循环血miRNA对肿瘤早期诊断、肿瘤分期和预后效果等方面具有重要的警示作用，而且也可以很好地评价化疗的效果[5，6]。大部分学者研究1个miRNA基因或2个可以在一定程度上评价肿瘤治疗的效果，虽然血清中游离的miRNA 可能是来自裂解的肿瘤细胞，但也不能排除差异表达的miRNA是作为类激素效应而由其他器官炎症引起的介导反应[7，8]。所以在锁定与肺癌预后有关的miRNA之前，有必要验证血清中游离的miRNA是否来源于病灶区域癌细胞的裂解。本课题同时利用组织和血清样本检测miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1表达水平，有助于提高筛选成功率。

研究[9，10]显示miR-19a、miR-19b可以在膀胱癌、小泡状横纹肌肉瘤、结肠癌等肿瘤患者的血清中呈现高表达，而且结果显示miR-19a、miR-19b的表达与肿瘤血管的发生、预后、复发及其生存率具有密切关系。也有研究[11，12]显示将miR-19a、miR-19b应用于NSCLC患者的研究可以明显出现高表达，而且化疗后明显降低。外周血miR系列基因的稳定性比较强，不受外界环境及自身的生理状态的影响，可以准确地反应人体自身的生理变化[13]，因此外周血miR系列基因可以应用于NSCLC诊断及预后的评价。本研究结果显示化疗前NSCLC患者存在明显miR系列基因高表达，而通过3个疗程化疗后患者的miR系列基因明显降低，说明miR系列基因可以评价NSCLC诊断及预后。

miR-17-3p、miR-18a、miR-20a和miR-92-1在多种肿瘤细胞中表达异常[14，15]。而且在大多数恶性肿瘤中细胞或组织中，miR系列基因的表达均显著升高。因此在肿瘤的诊断及治疗中可以通过监测患者的miR系列基因的变化可以判断NSCLC患者的发病情况、化疗后患者的康复情况，也可以作为判断NSCLC患者预后的重要指标。本研究的结果也显示miR-17-3p、miR-18a、miR-20a和miR-92-1在NSCLC患者化疗前存在高表达，而且通过化疗后上述指标明显降低，说明血清miR系列基因可以评价NSCLC患者的预后。因此本研究将NSCLC患者的预后与血清miR系列基因表达进行研究，表明血清miR系列基因表达在NSCLC患者中的高表达。

综上所述，血清miR系列基因表达水平在NSCLC患者明显升高，治疗后miR系列基因表达明显下降，血清miR系列基因有可能成为预测NSCLC预后的分子标志物。

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（收稿日期：2016-11-09）