禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因的克隆表达及抗原性鉴定

摘要：为了对禽多杀性巴氏杆菌（Pm）外膜蛋白H （Omp H）的免疫学活性进行鉴定，本研究根据已发表的多杀性巴氏杆菌X-73株（U50907.1）设计了两对引物，用PCR 方法扩增了禽多杀性巴氏杆菌CVCC44801 株的Omp H，扩增片段为1 348 bp （ORF为1 056 bp）。扩增的Omp H 与GenBank 中登录号为AE004439.1（Pm70株）、EF635422.1（C44-1株）、EU016232.1（P52株）、JQ082510.1（XJ121株）、U50907.1（X-73株）、U52200.1（P-1059株）的序列比对分析结果表明，其核苷酸同源性范围在80.2%～98.4%，氨基酸同源性范围在79.6%～98.5%。扩增了去信号肽的Omp H 基因，构建原核重组表达质粒pET-Omp H，转化BL21 并诱导表达，SDS-PAGE 结果表明，表达蛋白約为56 ku，与预期分子量的大小相符；蛋白免疫印迹试验结果表明，该蛋白具有良好的免疫学活性，为建立禽Pm血清学检测方法以及禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白疫苗的研究奠定了基础。

关键词：禽多杀性巴氏杆菌；外膜蛋白H基因；原核表达

中图分类号：S 858.32 文献标识码：A文章编号：1008-0384（2018）05-451-05

Abstract： The immunological activity of the outer membrane protein H （Omp H） of Pasteurella multocida （Pm） was identified. Based on the published data onP. multocida strain X-73 （U50907.1），two pairs of primers were used to amplify the Omp H of P. multocida strain CVCC 44801 by PCR.The amplified fragment was determined to be 1 348 bp （ORF at 1 056 bp）. The sequence alignment on Omp H of Pm70， C44-1， P52， XJ121， X-73 and P-1059 with those registered in GenBank showed a nucleotide homology between 80.2% and 98.4% and an amino acid homology between 79.6% and 98.5%. The recombinant plasmid pET-Omp H was constructed and transformed into BL21. The expressed protein was about 56 ku， which was close to the expected molecular weight. The western blot also confirmed its immunological activity. The results would provide the information for the establishment of a viable serological detection method and an applicable Omp vaccine against P. multocida.

Key words： Pasteurella multocida；Omp H gene；prokaryotic expression

由多杀性巴氏杆菌Pasteurella multocida，Pm引起的畜禽共患传染病，称为巴氏杆菌病，又称出血性败血症；巴氏杆菌病的病原属于巴氏杆菌科Pasteurellaceae巴氏杆菌属Pasteurella[1]。多杀性巴氏杆菌抗原结构复杂、血清型众多，对家养和野生的多种动物和人均有致病性。禽感染多杀性巴氏杆菌（多以 A 型为主）引起的疾病称为禽巴氏杆菌病，又名禽霍乱（Fowl cholera），主要是鸡、鸭、鹅、火鸡的一种急性败血性传染病；发病率和死亡率均很高，也可呈慢性型和良性经过；急性型突然发病，下痢，出现急性败血症症状，慢性型发生肉髯水肿和关节炎[1]。禽巴氏杆菌病是家禽的烈性传染病，国家把其列入二类传染病。该病呈散发流行，主要发生春秋两季，南方各省较为流行，是最为重要的细菌性传染病之一，对养殖业造成很大的危害。

福建农业学报第33卷第5期陈翠腾等：禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因的克隆表达及抗原性鉴定外膜蛋白（Outer membrane proteins，Omps） 作为主要的免疫原，由于具有良好的免疫原性，可以刺激机体保护性抗体的产生，在病原菌和宿主的相互作用过程中起着十分重要的作用。不同血清型分离株的OMPs彼此之间存在共同的抗原成分，因此可产生交叉保护作用。Omp H 是存在于Pm外膜上的一种主要蛋白，是一种孔道形成蛋白，其暴露于菌体的表面，是非特异性细菌外膜脂蛋白超家族中的一员[2]。有研究表明，纯化的天然外膜蛋白H与全菌诱导相同的保护率，均能诱导产生高水平的抗体 [3]。表明外膜蛋白H可作为疫苗合适的候选基因，而且可以利用该蛋白建立 ELISA 快速诊断试剂盒。

本研究扩增了禽多杀性巴氏杆菌CVCC44801 株的外膜蛋白H基因，并在大肠杆菌中进行了表达，并对表达的蛋白进行了抗原性鉴定。

1材料与方法

1.1菌株和血清

禽多杀性巴氏杆菌CVCC44801株（C48-1株）株购自中国兽医药品监察所；鸭抗Pm 阳性血清由本实验室制备。

1.2主要试剂

2×Easy Taq PCR SuperMix、Trans5α Chemically Competent Cell、BL21（DE3）、鼠抗His 标签蛋白单克隆抗体、HRP 标记的羊抗鸭IgG和羊抗鼠IgG均购自北京全式金生物技术有限公司；pMD18-T 载体和DNA Marker均购自TaKaRa公司；DNA回收试剂盒及质粒小量提取试剂盒为Omega公司生产；T4 DNA 连接酶和BamHⅠ、XhoⅠ限制性内切酶购自宝生物工程（大连）有限公司；原核表达载体pET-32a购自Novagen公司。蛋白质Marker（PageRulerTM Prestained Protein Ladder 26616）购自Fermentas公司；IPTG购自Sigma公司。

1.3引物

参照GenBank数据库上已发布的多杀性巴氏杆菌X-73株（GenBank登录号：U50907.1）的Omp H 基因序列，运用Oligo 7软件设计基因扩增和表达2对引物。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物具体信息如表1所示。HF2 和HR2 用于扩增去信号肽Omp H 基因片段，下划线为BamHⅠ和XhoⅠ 位点。

1.4目的基因PCR扩增

PCR反应体系50 μL：取1 μL培养的菌体悬液作为PCR 模板，2×Easy Taq PCR SuperMix 25 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，加入22 μL的 ddH2O。PCR扩增程序如下：预变性94℃ 5 min；变性94℃ 30 s，退火54℃ 30 s，延伸72℃ 1 min 30 s，35个循环；然后72℃再延伸10 min，4℃ hold。PCR产物进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳。PCR产物用Omega公司的胶回收试剂盒回收。

1.5目的基因的克隆与鉴定

将通过引物HF1和HR1 进行PCR扩增得到的目的基因片段连接到克隆载体pMD18-T，然后转化到感受态细胞Trans5α，挑选出阳性克隆菌送上海生工生物工程技术公司进行测序。测序结果结合GenBank数据库上已经发表的Pm70、C44-1、P52、XJ121、X-73和P-1059（GenBank登录号依次为：AE004439.1、EF635422.1、EU016232.1、JQ082510.1、U50907.1和U52200.1）禽多杀性巴氏杆菌Omp H 基因进行序列比对。

1.6原核表达载体的构建及鉴定

将通过引物HF2 和HR2 扩增的去除信号肽Omp H目的基因和原核表达载体pET-32a质粒均用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切，然后胶回收。将双酶切后的Omp H 基因片段与载体进行连接，将连接后的产物转化Trans5α大肠杆菌，然后挑取转化子进行扩大培养，提取质粒，将BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定正确的重组质粒pET-Omp H 送上海生工进行测序。

1.7目的基因的诱导表达及蛋白电泳分析

将测序结果正确的pET-Omp H 质粒转化表达菌BL21（DE3），然后挑取单菌落于培养基中， 37℃条件下振荡培养至OD600值范围在0.4～0.6，然后加入IPTG（终浓度为1×10-3 mol·L-1）进行诱导表达5 h。表达产物用12%蛋白胶进行SDS-PAGE电泳检测。

1.8免疫印迹试验

按照常规的半干电转印法进行转膜，转印的PVDF 膜用5%脱脂乳进行封闭过夜，用鸭抗Pm 阳性血清（用5%脱脂乳进行1∶50稀释）作为一抗，在37℃条件下孵育1 h，用HRP 标记的羊抗鸭IgG （1∶500 倍稀释）作为二抗，在37℃条件下孵育1 h，以二氨基联苯胺（DAB）为底物进行显色，观察显色结果。质粒His标签蛋白的免疫印迹方法基本同上所述，不同点在于用鼠抗His 标签蛋白单克隆抗体（1∶5 000 倍稀释）作为一抗，以羊抗鼠IgG（1∶5 000 倍稀释）作为二抗。

2结果与分析

2.1Omp H基因的扩增与克隆

如图1所示，2对引物PCR扩增Omp H基因得到预期大小的2个目的片段。将HF1和HR1 PCR扩增的目的基因连接到克隆载体pMD18-T后转化到感受态细胞Trans5α，阳性重组质粒的测序结果表明：Omp H 片段为1 348 bp，包含完整的ORF，该ORF为1 056 bp， 编码351 个氨基酸，其中N′端20 位氨基酸为信号肽序列。利用HF2 和HR2 扩增去掉N′端20 位氨基酸信号肽的大小为996 bp的Omp H 基因片段。

2.2OmpH 的序列分析

CVCC44801 株的Omp H 基因与GenBank 中登录号为AE004439.1（Pm70株）、EF635422.1（C44-1株）、EU016232.1（P52株）、JQ082510.1（XJ121株）、U50907.1（X-73株）、U52200.1（P-1059株）的序列比对分析结果表明，其核苷酸同源性为80.2%～98.4%，氨基酸同源性为79.6%～98.5%。分析发现，CVCC44801 株外膜H蛋白的228～233位氨基酸区域存在缺失，而Pm70、P52、C44-1、X-73、XJ121、P-1059不同分离株外膜 H蛋白在90～103位和222～239位氨基酸存在部分缺失，這也许可以解释为什么Pm 不同分离株Omp H 基因和编码的蛋白长度不同（图2）。

2.3表达载体的构建及鉴定

利用引物HF2 和HR2 扩增Omp H基因（去掉N′端20 位氨基酸信号肽），构建出重组质粒pET-Omp H，通过XhoⅠ和BamHⅠ双酶切获得目的条带为996 bp，双酶切电泳图结果如图3所示。pET-Omp H 的测序结果与原测序结果一致。

2.4外膜蛋白H 基因的原核表达及免疫印迹试验

用构建好的表达重组质粒pET-Omp H 转化表达菌BL21（DE3）， 将IPTG 诱导表达的产物进行SDS-PAGE 电泳，电泳结果如图4所示，在约56 ku 处可见一条明显的表达带，与预期的分子量大小一致，空质粒诱导表达的标签蛋白约为20 ku。标签蛋白Western blot结果表明表达的蛋白为目的蛋白，目的蛋白Western blot结果表明表达的蛋白具有免疫学活性，western blot 检测结果如图5所示。

3讨论与结论

多杀性巴氏杆菌抗原结构复杂，主要抗原为荚膜抗原（K抗原）和菌体抗原（O抗原）。 利用荚膜抗原的间接血凝试验可将多杀性巴氏杆菌分为4个血清型，分别为 A、B、C、D，后来C型取消，增加了E和F型2個血清型[4]。另外依据多杀性巴氏杆菌菌体抗原的琼脂扩散沉淀试验，将其分为1～16 个血清型[5]。现已发现感染禽类的多杀性巴氏杆菌多以 A 型为主。程龙飞等[6]研究表明，过去三十几年来，我国流行的禽源多杀性巴氏杆菌的荚膜抗原和菌体抗原类型主要还是以A：1型为主。目前，国内常用的禽霍乱疫苗主要有灭活苗和弱毒苗。禽霍乱灭活苗和弱毒苗各有优缺点，灭活疫苗只能保护动物机体免受同源菌株的攻击，而弱毒疫苗不仅可以保护动物机体免受同源菌株的攻击，还能在一定程度上保护动物机体免受异源菌株的感染，但存在免疫期短，需注意安全剂量，易出现毒力返强的现象[1]。外膜蛋白H作为禽多杀性巴氏杆菌主要的毒力因子之一，是重要的免疫原，以它作抗原研制亚单位疫苗已经成为当前研究的热点。

禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H，作为重要的免疫原，可诱导较高水平的保护性抗体，Lee 等发现以Omp H 免疫小鼠后可抵抗Pm 强毒的攻击[7]，研究表明抗 Omp H 的单抗可以保护小鼠免受多杀性巴氏杆菌致死性的攻击，同时还能介导白细胞扩散至感染部位[8]，所以可以把它作为候选疫苗。又有研究表明，纯化的禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H与全菌相比，诱导相同的保护率，都能够诱导较高水平的ELISA 抗体，但是通过重组表达的禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H诱导的保护率却比较低，推测其中原因可能是，重组表达出的蛋白质通常是变性的蛋白，其空间构想与纯天然的蛋白质有所不同 [3，9]。我国对禽多杀性巴氏杆菌Omp H基因序列分析表明，国内禽Pm菌株Omp H基因非常保守[10-11]；曹素芳等对禽Pm菌株 C48-1的Omp H 重组亚单位疫苗的免疫效果进行研究，结果显示该重组亚单位疫苗具有良好的免疫原性，可诱导特异性抗体的产生，能保护机体免受同源菌株的致死性攻击，而且比禽多杀性巴氏杆菌弱毒疫苗的免疫效果要好[12]。

与灭活疫苗相比，Omp H 重组亚单位疫苗去除了病毒颗粒中一些引起不良反应的成分，具有更高的安全性，也不存在灭活剂影响病毒抗原的问题，优点突出。由于多杀性巴氏杆菌血清型众多，同类抗原的变异性强，极大地增加了传统多价疫苗研制的难度，严重影响了对多杀性巴氏杆菌病的有效防控。由于不同血清型禽多杀性巴氏杆菌的Omp H 基因存在差异，会导致抗原性的改变，所以对于预防不同血清型毒株感染的效果也会有差异，而传统疫苗也存在这一问题。可在Omp H 重组亚单位疫苗研究的基础上，通过基因工程技术，将不同血清型禽多杀性巴氏杆菌Omp H蛋白的重要抗原表位进行整合，制成可同时预防多种血清型毒株感染的Omp H 基因工程亚单位疫苗。相信随着对禽多杀性巴氏杆菌Omps免疫原性和保护性研究的进一步深入，将有望开发出禽Pm外膜蛋白的有效疫苗。

本研究以pET-32a为表达载体，表达的去信号肽禽多杀性巴氏杆菌Omp H 蛋白经western blot 检测，有免疫学活性。说明该表达的蛋白可以用于进一步的研究，如制备禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白疫苗、建立禽Pm血清学检测方法等。

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（责任编辑：林海清）