穴位埋线对慢性疲劳大鼠免疫功能的影响

【摘 要】目的：探讨穴位埋线治疗慢性疲劳综合征（CFS）的可能机理。方法：采用悬吊冷水游泳复合应激因素复制慢性疲劳动物模型，随机分为正常组、模型组、穴位埋线组。治疗12天后作免疫功能相关指标检测，同时作免疫组化及图像分析。结果：穴位埋线组的胸腺指数、脾脏指数、脾淋巴细胞增殖转化能力、血清白介素-2（IL-2）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）测定值与模型组相比较P﹤0.01或P﹤0.05；穴位埋线组与模型组相比较，IL-2和TNF-α光密度降低，表达增强，P﹤0.01；结论：穴位埋线能增强慢性疲劳大鼠的免疫功能。这可能是其治疗CFS的机制之一。

【关键词】慢性疲劳综合征；穴位埋线；免疫功能；血清白介素-2；肿瘤坏死因子-α

【文章编号】1004-7484（2014）05-2952-03

1 材料和方法

1.1 实验动物

青年健康SD雄性大鼠36只，3-4月龄，体重（200±20）g，由贵阳医学院实验动物中心提供[合格证批号为SCXK-（黔）2002-0001]。

1.2 药物及主要试剂

刀豆蛋白A（ConA）和四甲基偶氮唑盐（MTT）均为Sigma公司产品IL-2放免试剂盒（天津九鼎医学生物工程有限公司）TNF-α放免试剂盒（天津九鼎医学生物工程有限公司）兔抗大鼠IL-2 试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）兔抗大鼠TNF-α试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）PV-6001兔二步法检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）

1.3 仪器

550型酶联免疫检测仪（伯乐太平洋有限公司）二氧化碳培养箱（日本）

1.4 方法

1.4.1 实验动物分组

SD雄性大鼠36只，随机分为正常对照组（对照组）、CFS模型组（模型组）、穴位埋线组，每组12只。

1.4.2 造模方法

适应性喂养7天，采用悬吊冷水游泳复合应激因素复制慢性疲劳动物模型。连续12天[1]。

1.4.3 治疗方法

⑴ 正常组：不做任何治疗，每天空抓一次，共12天。

⑵ 模型组：不做任何治疗，每天空抓一次，共12天。

⑶穴位埋线组：根据华兴邦的大鼠穴位定位图[2]，选择肝俞、脾俞、肾俞，常规消毒后， 将羊肠线0号剪成0.5cm数小段，穿入一次性埋线针，刺入穴位，缓慢将羊肠线注入穴位，确认羊肠线已埋入穴位内然后出针。左右同时埋线，埋线一次，共12天。

1.4.4 标本采集

治疗结束后，模型组死亡2只，感染2只，死亡原因为游泳溺水。埋线组感染2只。剩余大鼠用10%水合氯醛麻醉（100g/0.3ml），腹股沟处局部消毒。剪开腹股沟处皮肤分理出腹股沟动脉并剪断，离心塑料管取血2ml，放到台式高速离心机上3000r/min离心10min。吸取血清置于-30℃冰箱保存待测。

1.4.5 指标检测

1.4.5.1 免疫器官指数

将处死后的各组大鼠分别取出胸腺、脾，去除脂肪、筋膜后称重，计算胸腺指数和脾指数，单位mg/g体重。

1.4.5.2 脾淋巴细胞的增殖转化能力

采用MTT法检测脾淋巴细胞的增殖情况。无菌取脾， 常规制成淋巴细胞悬液，调细胞浓度为1.5×106/ml， 加入 96 孔板中， 再加入刀豆蛋白 A （ 终浓度为 5μg/ml）， 置于 CO2 培养箱中60h， 培养结束前 4h 加入MTT， 培养结束后加入二甲基亚枫， 于酶标仪 570 nm 处比色测定吸光度值。

1.4.5.3 IL-2和TNF-α

采用放射免疫检测法（RIA），按天津九鼎医学生物工程有限公司的放免药盒说明书操作。

1.4.5.4 HE染色观察大鼠脾脏一般形态学变化

将分离取出称重后脾脏放于10%中性福尔马林固定24h，梯度脱水，二甲苯透明、石蜡包埋，切片（3-5um），HE病理染色观察脾脏一般形态学变化。

1.4.5.5 免疫组化测定

采用PV免疫组化染色法，按北京中杉金桥生物技术有限公司药盒说明书操作。

1.4.6 图像分析及统计学处理

用Biomias99图象分析系统对平均光密度进行图像分析。数据采用均数±标准差（ ±s）表示，采用SPSS12.0统计软件包进行统计分析，各组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVE ）和q检验。

2 结果及分析

2.1 免疫器官指数（表1）

表1 各组大鼠胸腺指数和脾指数比较（ ±s）

Table 1.The Comparison of Thymic index and Spleen index among Different Group（ ±S）

2.2 脾淋巴细胞增值转化力（表2）

2.3 血清白介素-2（IL-2）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）浓度值（表3）

2.4 HE染色结果

HE染色正常组（见图片1）。模型组大鼠脾脏红髓缩小，红髓所占比例减小。白髓萎缩，白髓所占比例减小。脾组织内脾小梁数量减少，体积缩小，排列紊乱。中央动脉玻变，中央动脉管壁增厚，变硬，纤维组织增生并玻变。（见图片2a～2b）。穴位埋线组比模型组有不同程度改善，（见图片3）。

2.5 免疫组化染色结果（表4）

由表4可见，与正常组相比，模型组平均光密度值升高， 白介素-2（IL-2）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达减弱P﹤0.01；与模型组相比，穴位埋线组平均光密度值降低， 白介素-2（IL-2）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达增强 P﹤0.01。详见图片（4-9）。

3 讨论

3.1 现代医学对CFS的认识

慢性疲劳综合征（chronic fatigue syndrome ， CFS）是现代医学新认识的一种疾病，由美国疾病控制和预防中心（CDC）于1988 年正式命名。这是一种以疲劳、低热（或自觉发热） 、咽喉痛、肌痛、关节痛、头痛、注意力不易集中、记忆力差、睡眠障碍和抑郁等非特异性表现为主的综合征。CFS的原因尚不确定，主要有两种学说：生物感染和由感染直接介导的免疫功能失调[3] 。

3.2 免疫与CFS的关系

很多研究表明[4～5]， CFS 患者存在免疫功能的异常， 主要表现为细胞免疫功能低下。此外，还存在T效应细胞功能、淋巴细胞增殖功能及T细胞亚群数目与比值的改变等 [6]。因此，有人也将CFS 称为“慢性疲劳免疫功能障碍综合征”。

3.2.1 胸腺指数和脾脏指数与CFS

脾脏及胸腺是淋巴细胞的生发中心，由脾细胞分泌的转移因子（TF）及胸腺分泌的胸腺素在免疫疾病防治中具有重要的实用价值，因此研究针灸等对免疫器官重量的影响，可推测其对免疫功能的正向调节作用。

3.2.2 脾淋巴细胞增殖转化能力与CFS

T 淋巴细胞是重要的免疫细胞， 主要介导细胞免疫， 并可以调节机体的免疫功能。一般认为，机体的细胞免疫功能差，淋巴细胞转化率低；反之，细胞免疫功能良好，淋巴细胞转化率也较高。因此， 根据淋巴细胞转化率（增殖指数）的高低， 可判断机体的细胞免疫功能状态[7]。

3.2.3 IL- 2和TNF-α与CFS

3.2.3.1 IL- 2与CFS

IL- 2主要由活化的CD4+ T细胞及少量CD8+ T细胞产生，是一种免疫调节淋巴因子，是淋巴细胞、单核巨噬细胞等活化后产生的具有高活化的多功能的小分子蛋白。其能增强自然杀伤细胞（NK）活性，而且主要起调节作用，被称为NK细胞刺激因子。其主要生物学功能是增强NK细胞和CD8+ T细胞的活性，刺激此两种细胞产生γ干扰素（γ-INF），并能诱导IL-1β受体的生成。它能维持T细胞在体外的生长，激活多种免疫细胞，诱导生成等作用，而且T细胞产生的IL-2可进一步刺激其自身受体的表达和分泌，其水平反映了T细胞的功能状态，故IL-2被认为是一种重要的免疫调节因子，IL-2的产生能力可作为机体细胞免疫功能的重要指标。

3.2.3.2 TNF-α与CFS

TNF-α是由被激活的巨噬细胞和单核细胞产生的多肤类介质，在体内具有广泛的生物学作用，可诱导IL-1，IL-6、血小板活化因子（PAF）等细胞因子参与机体免疫调节作用，参与了多种疾病的病理过程，在免疫调节、炎症、以及某些慢性病等细胞反应中TNF具有重要作用。国外有学者[8-9] 对CFS患者与正常对照组进行了回顾性的对照研究，发现CFS患者与对照组比较TNF呈显著性升高。

3.3 祖国医学对CFS的认识

疲劳，在《黄帝内经》中多称为“倦”、“懈惰”、“困薄”、“身重”、“体重”、“四肢不举”等。《素问·五藏生成论》：“肝受血而能视，足受血而能步，掌受血而能摄”。指出肝藏血主疏泄的正常功能是人体活动能力的重要保证。脾主肌肉四肢，“脾病者身重”，“脾气虚则四肢不用”。《黄帝内经》论述“肾足少阴之脉”“是主肾所生病”，有“嗜卧”之症。“各脉者肾也……太过则令人懈惰”。肾主骨，生髓，海不足，则脑转耳鸣，胫酸眩冒，目无所见，懈怠安卧”。文献中疲劳涉及的脏腑主要为肝脾肾三脏。与情志、劳逸、气血、肝、脾、肾功能失调有关。

3.4 穴位埋线治疗CFS机理分析

穴位埋线疗法是集经穴、线、针刺的作用，将古老传统针灸术和近代组织疗法融为一体的治疗方法。它是将羊肠线埋入穴位，利用羊肠线对穴位的持续刺激作用达到治疗疾病的目的。从传统中医角度来看，埋线疗法的治疗作用主要体现在协调脏腑、疏通经络、调和气血、补虚泻实几个方面。

现代医学对埋线过程进行研究，发现在这个过程中机体内部的一些微观组织结构也在发生着相应的变化。传统埋线疗法中的穴位局麻以及皮肤切割，都能对穴位、神经以及整个中枢产生一种综合作用，使组织器官的活动能力加强，血液循环及淋巴回流加快，局部新陈代谢增强，其营养状态得到改善。产生的疼痛信号传到相应的脊髓后角内，可以引起脊髓水平的抑制效应，调节其所支配的内脏器官。此外，羊肠线作为一种异种蛋白，可诱导人体产生变态反应，使淋巴组织致敏，配合抗体、巨噬细胞来破坏、分解、液化羊肠线，使之分解为多肽、氨基酸等。崔氏等[10]观察足三里穴位埋线对脾虚证大鼠免疫功能的影响，结果发现穴位埋线对脾虚大鼠脾淋巴细胞的转化功能有明显增强作用，对巨噬细胞的吞噬功能亦能明显提高，并能增加脾虚大鼠的脾重指数与胸腺重量指数，提示穴位埋线对脾虚证的治疗机理可能与调节细胞免疫及非特异性免疫有关。穴位埋线治疗慢性疲劳大鼠未见相关报道，本实验结果表明：穴位埋线能使慢性疲劳大鼠胸腺指数和脾脏指数提高、脾淋巴细胞增殖转化能力增强、血清IL-2和TNF-α增加，从而提高了免疫功能。这也可能是穴位埋线治疗慢性疲劳综合征的机制之一。当然，穴位埋线对机体的免疫调节还表现在更多方面和更多层次，有待于今后作进一步研究。

参考文献

[1] 尹喜玲，肖颖，李可基.多重应激建立慢性疲劳综合征动物模型的研究. 中国运动医学杂志，2005，24（4）：452-456.

[2] 华兴邦.大鼠穴位图谱的研制.实验动物与动物实验，1991；11（6）：1.

[3] Jain SS， Delisa JA. Chronic fatigue syndrome： a literature review from a physiatric perspective. AMJ Phys Med Rehabil 1998；77（2）：160-7.

[4] Caligiuri M. Phenotynic and functional deficiency of naturalkiller cells in patients with chronic fatigue syndrome. J Immunol ， 1987 ，139 ：3306～3313.

[5] Bates Dw. Clinical labortory test findings in patients with chronic fatigue syndrome. Arch Intern Med ，1995 ，155 ：97～103.

[6] 王天芳，王琳，张翠珍.慢性疲劳综合征的研究进展.中国公共卫生，2002，18（8）：1006-1008.

[7] 许倩， 杨松鹤， 赵联伟， 陈志宏. 中药天年饮对衰老大鼠脾淋巴细胞增殖转化能力的影响 [J]. 中国组织工程研究与临床康复， 2007， 11（12）：2368-2370.

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[9] Ronald B Moss， Alexander Mercandetti， Aristo Vojdani. TNF-α and chronic fatigue syndrome[J]. Journal of Clinical Immunology， 1999， 19（ 5） ：314-316.

[10] 崔瑾，欧桂珍，杨涛，等.穴位埋线对脾虚证大鼠免疫功能影响的实验研究.中国医药学报， 1999， 14 （6）：14.