电针对抑郁大鼠海马E—选择素和抵抗素蛋白表达的影响

摘要：目的 观察电针对慢性应激抑郁模型大鼠海马E-选择素和抵抗素蛋白表达的影响，探讨电针对抑郁症脑内微环境的作用机制。方法 采用慢性应激结合孤养方法造模。将40只SD大鼠随机分为空白组、模型组、电针组、氟西汀组，每组10只。于每日造模前1 h，电针干预“百会”、“印堂”，频率2 Hz，电流强度0.6 mA，每次20 min；氟西汀灌胃干预，用药剂量10 mg/kg，给药容积5 mL/kg。采用生物素标记抗体芯片技术检测大鼠海马E-选择素和抵抗素蛋白表达水平。结果 与空白组比较，模型组大鼠海马E-选择素和抵抗素蛋白水平上调（fold change=1.23，1.22）；与模型组比较，电针组、氟西汀组E-选择素水平下调（fold change=0.65， 0.62）、抵抗素表达水平下调（fold change=0.76，0.65）。结论 电针干预可下调慢性应激抑郁模型大鼠海马E-选择素和抵抗素蛋白表达。

关键词：电针；抑郁症；慢性应激；海马；血管内皮细胞；E-选择素；抵抗素；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.11.017

中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）11-0056-03欲减退、认知障碍等。生物素标记抗体芯片技术具有强大的监视细胞内基因表达、研究蛋白与大量潜在相关分子相互作用的功能，能很好地满足进行蛋白质组全面研究的要求。本研究采用该技术，观察电针对慢性应激抑郁模型大鼠海马E-选择素和抵抗素蛋白表达的影响，探讨电针对抑郁症脑内微环境及血管内皮功能的作用机制，拓展针刺抗抑郁的机理研究。

1 材料与方法

1.1 动物

40只雄性SD大鼠，清洁级，体质量（200±20）g，北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2004-2007。实验前适应性喂养1周。

1.2 药物、试剂与仪器

盐酸氟西汀分散片，礼来（苏州）制药有限公司，批号J20120001。BCA试剂盒（Pierce公司，货号23227）；AAR-BLM-1试剂盒，美国RayBiotech公司；芯片，批号4015806、4015807，包括膜芯片（RayBio® Biotin label-based Rat antibody array 1）；标记试剂、终止液、封闭缓冲液、红外荧光剂-链霉亲和素、透析管和浮漂、20×的洗液Ⅰ、20×的洗液Ⅱ、纯化柱、孵育盒。电针仪（华佗牌，SDZ-Ⅱ型），红外荧光扫描仪（Licor-Odyssey，美国LI-COR公司）。

1.3 造模

参照文献[1]方法改进，大鼠共随机接受28 d各种不同的应激刺激，包括断食24 h、断水24 h、夜间光照12 h、冷水游泳（4 ℃、5 min，水深30 cm）、振荡30 min、夹尾2 min、束缚3 h。

1.4 分组与处理

采用随机数字表将大鼠分为空白组、模型组、电针组、氟西汀组，每组10只。空白组动物不接受任何刺激且群养，自由摄食饮水饲养。模型组动物孤养，且每日进行慢性应激造模处理。电针组动物孤养，且每日进行慢性应激造模处理，同时应激刺激前1 h进行电针干预。针刺穴位参考《实验针灸学》[2]，选取“百会”、“印堂”，针具用30号33 mm毫针，平刺进针，深度为5～10 mm；电针频率为2 Hz，电流强度为0.6 mA，以大鼠头部微颤为宜，每次留针20 min。氟西汀组动物孤养，且每日进行慢性应激造模处理，同时在每日应激刺激前1 h给予盐酸氟西汀片灌胃干预，用药剂量为10 mg/kg，给药容积为5 mL/kg。

1.5 取材

造模28 d后，灌流固定，取脑。将每组10个海马组织混合，利用透析管透析，测定相关蛋白浓度，然后用生物素进行标记。经过封闭和孵育后，利用红外荧光扫描仪进行扫描。采用仪器自带分析软件提取数据。

1.6 蛋白芯片检测

1.6.1 样品透析 将大鼠海马冰上解冻，取200 μL组织裂解液加入透析管中，然后在4 ℃、4000 mL PBS（pH=8）中边搅拌边透析。每3 h更换透析液1次。

1.6.2 蛋白浓度测定 采用BCA试剂盒检测淋巴液蛋白浓度。

1.6.3 生物素标记样品 将标记试剂小管快速离心，管中加入500 μL PBS溶解粉末，上下吹打将标记试剂混匀，制备成标记试剂溶液；向新的离心管中加入适当量的标记试剂，快速混匀，此后，每5 min轻弹离心管以混合反应试剂，摇床上室温孵育30 min；加入5 μL终止液，用纯化柱去除未与芯片上蛋白结合的生物素，将柱子放入50 mL收集管中，1000 g离心3 min，去掉储存液，重复2次此操作后，清洗干净柱子，将柱子放入一个新的50 mL离心管中，缓慢将标记好的样品加入树脂床的中央。

1.6.4 封闭与孵育 用镊子拖着膜或夹着膜的边缘将膜缓慢浸没到2.5 mL封闭缓冲液中，有标志的面朝上，避免气泡产生，盖上孵育盒的盖子，室温振荡孵育1 h；用抽液泵抽去封闭液，每张膜芯片加2.5 mL封闭液稀释好的样品，盖上盖子，包上塑料薄膜，4 ℃过夜；抽去样品，每个孵育盒中加入约3 mL洗液Ⅰ，室温振荡洗膜，洗膜4次，每次5 min；抽去1×洗液Ⅰ，加入洗液Ⅱ，室温振荡洗膜，洗膜3次，每次5 min；抽去洗液Ⅱ，每张膜加入2.5 mL用封闭液8000倍稀释的CW800-链霉亲和素；室温避光振荡孵育2 h；洗膜（步骤同上）。

1.6.5 红外荧光扫描 设定扫描仪波长为800扫描通道，扫描强度为7.0，分辨率为42 μm。采用仪器自带分析软件提取数据，采用AAR-BLM-1的数据分析软件进行数据预分析。

2 结果

2.1 电针对大鼠海马E-选择素蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠海马中E-选择素表达增强（fold change=1.23），而电针组（fold change=0.65）、氟西汀组（fold change=0.62）表达均低于模型组。见图1。

2.2 电针对大鼠海马抵抗素蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠海马抵抗素表达增强（fold change=1.22），而电针组（fold change=0.76）、氟西汀组（fold change=0.65）表达均低于模型组。见图2。

3 讨论

生物芯片的概念起源于20世纪80年代中期，包括基因芯片、蛋白芯片和芯片实验室三个领域。蛋白芯片技术，是将各种蛋白质有序地固定在滤膜、载玻片等载体上，然后将用特定荧光抗体标记的蛋白与芯片作用，并且漂洗未能与芯片上蛋白质结合的成分，再利用荧光扫描仪对芯片上各点的立体空间进行比较，以达到测定蛋白的目的。其本质是利用蛋白质之间的相互作用，对样本中存在的特定蛋白质进行检测。作为微电子生命科学、医学和信息学等学科交叉的综合产物，蛋白芯片相较于其他分子生物学分析方法，具有实用性强、快速、准确、高通量、高灵敏度等特点。关于Raybiotech蛋白芯片的应用，Ying Lin等[3]用此技术来分析人细胞因子、趋化因子、生长因子等，发现生物素标记的基于抗体芯片技术可以提供数百个蛋白分析，证明其可作为临床研究实际有力的手段。Ruochun Huang等[4]应用此技术筛选出区分卵巢癌患者和健康人的生物标志物6个，区分类良性肿瘤和卵巢癌的生物标志物11个，正确率分别为94%、87%。这都表明蛋白芯片在疾病生物标志物的筛选和药物靶标等方面具有广泛的应用价值。对于本实验筛选抑郁模型大鼠脑内差异性表达蛋白，探查可能的针刺作用途径，深入研究针刺抗抑郁提供了可靠线索。

本研究将每组10个样品进行混合，采用fold change，即两组样本蛋白表达量均值之比的方法进行差异分析。这种方法直观地表现了组间的蛋白表达差异，便于筛选针刺作用的可能靶点。

海马是边缘系统的重要组成部分，不仅对与个体生存有关的情感反应有着极为重要的生物学价值，而且与内分泌调节、内脏活动特别是记忆的形成均有着甚为密切的关系。脑影像学研究结果显示，抑郁症患者海马结构出现萎缩，且与抑郁程度呈正相关[5]。提示海马是抑郁症研究的一个重要结构。海马内环境是指海马周围的组织细胞及其分泌的各种因子，其形态学基础包括脑毛细血管内皮细胞及内皮细胞间紧密连接、基膜及毛细血管周围星形细胞突起。海马内环境中的血管内皮细胞主要发挥屏障、内分泌作用，同时参与血管的形成[6]。

E-选择素曾被称为“内皮细胞白细胞黏附分子”，是一种重要的细胞黏附因子，具有内皮特异性。E-选择素可介导白细胞黏附于内皮细胞，穿越血管壁，向血管外浸润。抵抗素是一种由脂肪细胞特异分泌的蛋白质，其与早期血管内皮细胞功能失调有关。张氏等[7]认为，抵抗素通过促进炎症标记物表达诱导血管炎症反应的发生，从而损伤血管内皮细胞并影响其功能。

综上所述，慢性应激可以导致大鼠海马E-选择素、抵抗素表达水平升高，而电针和氟西汀干预后，均可使E-选择素、抵抗素蛋白表达下调，从而改善血管内皮的功能，促进海马内环境的稳态。

参考文献：

[1] 戴巍，李卫东，卢峻，等.电针对慢性应激抑郁大鼠海马神经元凋亡及JNK信号转导通路的影响[J].针刺研究，2010，35（5）：330-334.

[2] 张露芬.实验动物学[M].北京：化学工业出版社，2010：150-156.

[3] Lin Ying， Ruochun Huang， Li-Pai Chen， et al. Profiling of cytokine expression by biotin labeled based protein arrays[J].Proteomics，2003，9：1750-1757.

[4] Ruochun Huang， Weidong Jiang， Jean Yang， et al. A biotin label- based antibody array for high-content profiling of protein expression[J]. Cancer Genomics Proteomics， 2010，7（3）：129-141.

[5] 李月峰，姜平，王冬青，等.正常与抑郁症成人女性海马体积的磁共振研究[J].中国临床解剖学杂志，2009，27（1）：61-63，66.

[6] 邱雅慧.血管内皮细胞的功能以及损伤修复与动脉粥样硬化[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11（10）：1927-1929，1933.

[7] 金铃，龙兆丰.抵抗素参与血管内皮细胞功能障碍的研究进展[J].国际内科学杂志，2007，34（5）：289-292.

（收稿日期：2014-01-29；编辑：华强）