基于nano,LCLTQOrbitrapMS/MS的香附四物汤干预原发性痛经模型小鼠卵巢组织差异表达蛋白筛选

[摘要] 采用nano LCLTQOrbitrapMS/MS蛋白质组学方法筛选鉴定香附四物汤干预原发性痛经模型小鼠卵巢组织中的差异表达蛋白，推测香附四物汤治疗原发性痛经的机制。采用雌激素和缩宫素联合造成原发性痛经模型，给药组连续灌胃给予香附四物汤3 d，于末次给药后1 h，取卵巢，经蛋白提取、变性、还原、烷基化、脱盐、酶解后，进行nano LC分离并在线连接电喷雾串联Orbitrap质谱分析，利用Thermo Proteome discoverer 1.4进行数据处理，筛选并鉴定差异表达蛋白，对差异表达蛋白进行生物信息学分析。随后采用Western blot法，将重要差异蛋白进行验证。正常组、模型组、给药组3组共有的差异蛋白106个，参与细胞过程的蛋白所占比例较大，其所参与的黏着连接、黏着斑等信号通路对细胞内各种信号通路均有调节作用。验证的ADRM1蛋白在模型组中，较正常组表达上调；给药后，较模型组表达下调。通过有效的比较分析，得到一些香附四物汤干预原发性痛经的差异表达蛋白，其中ADRM1蛋白有可能是香附四物汤作用的靶点。

[关键词] 香附四物汤； 原发性痛经； 蛋白质组学； 差异表达蛋白

原发性痛经（primary dysmenorrhea，PDM）多见于未婚或未育青年女性，发病率高达50%，其中严重影响工作和生活者占10%。中国高校女学生痛经发病率高达60%～80%[1]。由情致变化导致的气滞血瘀证是临床原发性痛经常见证候，生活、工作和周围环境所带来的压力使妇女产生愤怒或抑郁，气机郁滞，血行不畅，导致痛经。香附四物汤是临床经方，其组方药物如当归、香附等在气滞血瘀证痛经治疗中广泛使用。动物、细胞实验证明香附四物汤可改善原发性痛经导致的NEI系统紊乱和激素调节异常[26]。

蛋白质组学具有整体性和系统性特点，作为沟通中医药与现代医药2种科学体系的桥梁，为中医药认识疾病的方法、理论的现代科学表征体系提供了适宜的方法[7]。质谱技术是蛋白质组学的核心技术，目前用于蛋白质组学研究的质谱分析器包括离子阱质量分析器（IT）、四级杆（Q）、飞行时间分析器（TOF）、傅里叶变换离子回旋共振（FTICR）和轨道阱质谱分析器（Orbitrap）[8]。本文基于nano LCLTQOrbitrap平台，对原发性痛经模型小鼠卵巢组织差异表达蛋白进行分析，研究香附四物汤防治原发性痛经的分子机制。

1 材料与方法

1.1 动物

雌性健康C57BL/6小鼠，SPF级，体重（20±2）g，上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号SCXK（沪）20120002。

1.2 药物与试剂

按文献[6]方法制备香附四物汤；动物全蛋白提取试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司，批号BSP003130516]；BCA蛋白质定量检测试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司，批号SK3021130516]；二巯基苏糖醇（DTT，批号C325BA0008），碘乙酰胺（IAA，批号BB13BA0007），碳酸氢铵（NH4HCO3，批号B715BA0021）均购自生工生物工程有限公司；质谱级胰酶（美国Thermo公司，批号QB214128A）。实验用水为MilliQ去离子水。

1.3 仪器

Dionex Ultimate 3000 UHPLC液相系统（美国Thermo公司）；nanoESILTQVelos OrbitrapElite（美国Thermo公司）；Thermo Acclaim PepMap C18（100 μm × 2 cm）trapping柱；Thermo Acclaim PepMap RSLC C18（75 μm × 25 cm）分析柱；MilliQ超纯水机（美国Millipore公司）；Microfuge 22R高速冷冻离心机（美国Beckman Coulter公司）；真空冷冻干燥机（美国Labconco公司）。

1.4 组织样本的制备

实验动物分为3组，每组6只，香附四物汤组和模型组按文献方法[9]，通过雌激素和缩宫素联合复制原发性痛经模型，香附四物汤组按含生药6.43 g·kg-1剂量给药，模型组和正常组按同等条件给予等体积的生理盐水，连续灌胃给药3 d，于末次给药后1 h，处死小鼠，解剖，取卵巢，液氮速冻后，贮存于-80 ℃冰箱，备用。

1.5 蛋白质组学分析

1.5.1 组织全蛋白提取、烷基化、脱盐、酶解 按照试剂盒说明书提取卵巢全蛋白，采用Bradford法测定蛋白浓度。

用DTT对蛋白质还原，用IAA烷基化，向还原烷基化后的样品溶液中加入丙酮使蛋白完全沉淀，离心（25 000×g），弃上清，并将蛋白沉淀置于空气中，使残留丙酮挥发。向样品中加入50 mmol·L-1 NH4HCO3缓冲溶液，使蛋白质量浓度为5 g·L-1，充分振荡使蛋白溶解。向样品中加入胰酶，充分溶解后，于37 ℃振荡酶解过夜。最后，样品置于95 ℃振荡10 min 终止酶解，并于冷冻干燥机中将样品完全干燥。加入0.1%甲酸水100 μL，13 000 r·min-1，4 ℃离心，取上清液，质谱上样分析。

1.5.2 质谱分析 色谱条件：样品进样量1 μL，载样流速300 nL·min-1，载样时间5 min，分析流速200 nL·min-1；流动相A 为0.1%甲酸2%乙腈水溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱，5～35 min，3%～40% B；35～45 min，40%～85% B；45～48 min，85% B；48～50 min，85%～3% B。

质谱条件：电喷雾（ESI）离子源，离子源喷雾电压2.5 kV，加热毛细管温度250 ℃。一级质谱Orbitrap扫描范围350～1 800，一级质谱里选取信号最强的15个母离子做二级质谱分析，动态排除功能开启，时间90 s。二级质谱LTQ为CID碰撞，正离子模式，标准化碰撞能量35%，活化q值0.25，活化时间10 ms。

1.5.3 数据处理及生物信息学分析 使用ThermoProteome discoverer 1.4（内带SEQUEST搜库软件）搜索引擎对数据进行检索，检索数据库为鼠种属的UniProt数据库。

检索参数：m/z 350～5 000，母离子容忍度1×10-5 Da，碎片离子容忍度为0.8 Da，肽段和蛋白质鉴定FDR均小于1%。采用SIEVE v2.1软件进行无标定量分析寻找相关差异蛋白，组间表达量差异比率1.5以上（即ratio小于0.7或大于1.5），且ANOVA统计检验P小于0.05，视为差异蛋白。利用DAVID，GO，KEGG，STRING数据库进行蛋白功能注释及生物学过程等分析[10]。选择合适的通路用作蛋白的解释并为后续验证做参考。

1.6 蛋白质验证

采用Western blot方法，将筛选出的重要差异蛋白进行小鼠卵巢（包括正常组、模型组和给药组）蛋白验证。一抗为兔抗人ADRM1（1∶250）及GAPDH（1∶400）多克隆抗体，二抗为辣根过氧化物标记的山羊抗兔抗体（1∶1 000），加DAB显色后用Bandscan分析软件分析条带灰度，进行半定量比较分析，采用自身灰度值校正，以目的基因的条带灰度与管家基因GAPDH的灰度比值表示蛋白的表达水平。

2 结果

酶解样品，分别进样，经纳升液相分离后，使用Thermo LTQ Orbitrap Elite质谱仪分析，采用Tune and Xcalibur控制软件，得总离子流图（TIC），见图1。

质谱数据经搜索蛋白质数据库及数据处理后，正常组和模型组数据比较获得1 697个差异蛋白，使用DAVID数据库对其进行功能注释，这些差异蛋白根据功能分为细胞骨架、肌动蛋白、ATP结合、微管细胞骨架、普列克底物蛋白、神经元、肌原纤维、钙调蛋白相关、辅肌动蛋白类等197类。在功能已知蛋白中，参与组织细胞投影（cell projection organization，2.5%）、神经细胞分化（neuron differentiation，2.4%）、细胞压力反应（cellular response to stress，2.4%）等所占比例较大。

模型组和给药组获得628个差异蛋白，根据功能分为细胞骨架，普列克底物蛋白，PDZ，微管细胞骨架，辅肌动蛋白类，DNA修复，嘌呤核苷类等95类，主要为磷酸化蛋白质（phosphoprotein，32.8%）。

正常组和给药组获得843个差异蛋白，根据功能分为细胞骨架、肌动蛋白、肌原纤维、嘌呤核苷类、辅肌动蛋白类、普列克底物蛋白等121类，主要为磷酸化蛋白质（phosphoprotein，31.7%）。

3组共有的差异蛋白106个，GO注释表明其参与解剖结构发育（anatomical structure development）、发育过程（developmental process）、单个有机体发育过程（singleorganism developmental process）、系统发育（system development）、多细胞体发育（multicellular organismal development）、单多细胞体发育（singlemulticellular organism process）、多细胞体过程（multicellular organismal process）、生物调节（biological regulation）、细胞成分组织（cellular component organization）、细胞成分组织或生源（cellular component organization or biogenesis）、细胞发展进程（cellular developmental process）、单个有机体细胞进程（singleorganism cellular process）、细胞过程调节（regulation of cellular process）、细胞器组织（organelle organization）、细胞变异（cell differentiation）、神经变异调节（regulation of neuron differentiation）、蛋白质复合体亚基组织（protein complex subunit organization）等17个生物学过程，见表1，图2。

同时，使用KEGG pathway对差异蛋白质可能参与的信号通路进行分析发现，其主要参与了黏着连接（adherens junction）、黏着斑（focal adhesion）、磷酸肌醇代谢（inositol phosphate metabolism）、胰岛素信号通路（insulin signaling pathway）、白细胞跨内皮迁移（leukocyte transendothelial migration）、神经退行性失调（neurodegenerative Disorders）、磷脂酰肌醇信号系统（phosphatidylinositol signaling system）、嘧啶代谢（pyrimidine metabolism）、紧密连接（tight junction）、三羧酸循环（citrate cycle）等信号通路。

采用Western blot法，对卵巢样本（正常对照组、模型组和给药组各6个）中的蛋白ADRM1（adhesioegulating molecule 1）进行了验证，见图3，表2。以灰度值的平均值计，正常对照组表达量为1，模型组表达量为1.81，给药组表达量为1.20。

3 讨论

本实验采用shotgun蛋白质组学研究策略，运用2D LCMS/MS分析了香附四物汤干预原发性痛经模型小鼠卵巢组织中的差异表达蛋白。Shotgun蛋白质组学技术具有快速、简单、高通量、自动化的特点。实验过程操作无需经过复杂的双向电泳，影响因素较传统的2DE策略显著减少，因此结果可靠性更高。本实验中，从正常组和原发性痛经模型组共鉴定1 697个差异蛋白，原发性痛经模型组和香附四物汤给药组628个差异蛋白，正常组和香附四物汤给药组843个差异蛋白。3组共有差异蛋白106个，参与细胞过程的蛋白所占比例较大，其所参与的黏着连接、黏着斑等信号通路对细胞内各种信号通路均有调节作用，说明香附四物汤的作用靶点通路与细胞过程相关，这与课题组前期通过网络药理学方法预测出的结论是一致的[11]。

香附四物汤是治疗气滞血瘀证型痛经的经典方剂，其组方药味多为活血化瘀药物，该类药物在针对卵巢癌等恶性肿瘤的治疗中出现较多。课题组前期通过网络药理学方法预测结果提示该方中的活性成分有可能开发成为潜在的预防和治疗卵巢癌或其他妇科肿瘤药物。ADRM1是一种黏附调节分子，对泛素酶UCHL5活性有促进作用，此外，还介导了内皮细胞中的淋巴细胞黏附。在肺腺癌、肺鳞状细胞癌、膀胱癌、结肠癌、肝癌、肾癌、胃癌、卵巢癌等实体瘤中，存在ADRM1的过表达，该分子与肿瘤的发生密切相关。有研究表明，ADRM1是治疗卵巢癌的一个新靶点[12]。本实验结果表明，ADRM1在原发性痛经模型小鼠体内表达上调，而给予香附四物汤后，表达下降，该蛋白分子有可能成为香附四物汤防治原发性痛经的潜在靶点。但其对于原发性痛经的诊断意义及成为药物治疗靶标还需进一步扩大样本研究。痛经与卵巢癌是否存在关联以及香附四物汤对卵巢癌是否有治疗效果有待进一步评估验证。

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[责任编辑 马超一]