烟草CSN4基因的原核表达及纯化

摘要：以野生型烟草（Nicotiana tabacum）为试验材料，采用RT-PCR克隆获得CSN复合体亚基CSN4cDNA序列，基因登录号为 KC866360。序列分析表明，CSN4基因ORF长为 1194bp，编码398个氨基酸，蛋白分子质量为4378kDa。将CSN4构建至原核表达载体，获得重组子pET28a-CSN4/BL21（DE3），通过 Ni-IDA 亲和层析纯化目的蛋白，SDS-PAGE 和Western Blotting 检测，结果显示：025mM IPTG，15℃诱导16h获得浓度为0476mg/mL、纯度高达95%的CSN蛋白，为后续CSN4基因功能研究奠定了基础。

关键词：COP9信号复合体；基因克隆；原核表达；亲和纯化

中图分类号：Q78

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2017）02-0019-06国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.02.004

Abstract：In this study， the COP9 signal complex subunit CSN4 cDNA sequence was cloned by RT-PCR amplification from the wild type Nicotiana tabacum， accession number KC866360 in GenBank database. Sequence analysis showed that the length of open reading frame of N. tabacum CSN4 gene was 1194bp， encoding 398 amino acids， and the molecular weight of the protein is 43.78kDa. The recombinant pET28a-CSN4/BL21 （DE3） had been obtained by cloning CSN4 gene into the prokaryotic expression vector pET28a. The target protein was purified by Ni- IDA affinity chromatography， and the results of SDS-PAGE and Western Blotting indicated that the recombinant strain was induced with 0.25mM IPTG at 15℃ for 16h， the target protein concentration was 0.476mg/mL and its purity was up to 95%， which was laid the foundation for further study protein-function.

Key words：COP9 signalosome； gene clone； prokaryotic expression； affinity purification

COP9（constitutively photomorphogennic 9）信號复合体（CSN）最早是在拟南芥光形态建成中发现，是植物光形态发生的一个负调节子[1]，CSN复合体由 8 个不同亚基组成，可依次命名为 CSN1-CSN8[2]。这一复合体亚基从多种生物中被克隆及分析，如家蚕、菊花、甘蓝型油菜、苹果、水稻等[3-7]。研究表明CSN是通过对SCF型E3-泛素连接酶（cullin蛋白）的去NEDD化来调控泛素降解系统[8-10]。CSN4的蛋白序列所含有的PCI （proteasome-COP9-initiation factor）结构域，可调节蛋白酶体的装配、蛋白质之间的相互作用以及植物激素的合成代谢，从而介导植物的抗虫反应[11-14]。

实验室前期在烟草中成功表达了ChIFN-γ（chicken interferon gamma）[15]，应用烟草全基因组表达谱芯片，筛选出转基因烟草中的差异表达基因，通过GO及KEGG Pathway分析筛选与烟草抗虫相关的候选基因，推测转ChIFN-γ烟草的抗虫机制可能主要基于类似JAK-STAT和MAPK的信号途径调控下游特异性基因CSN4的表达引起依赖于JA或SA的植物防御反应，最终介导植物的抗病虫反应[12]。有研究表明植物中CSN沉默减少伤口反应伴随着茉莉酸（JA）的合成减少而水杨酸（SA）未改变，并且这些植物表现出对草食性幼虫和腐殖真菌病原体灰葡萄孢的抗性降低，不仅对植物发育有影响，而且引起依赖JA植物防御反应[14]。

本文旨在通过原核表达获得CSN4活性蛋白，为进一步研究ChIFN-γ与CSN4蛋白的互作关系，从而为进一步阐明转基因烟草ChIFN-γ调控的信号转导途径奠定基础，对开发CSN4蛋白，提高烟草的抗虫性及品质意义显著。

1材料与方法

11材料与试剂

幼苗期40d烟草（Nicotiana tabacum）由贵州省烟草科学研究院提供；表达宿主菌 BL21（DE3）、原核表达载体pET-28a购自默克（中国）公司；限制性切酶EcoRΙ、SalΙ、Taq 酶、DL2000 DNA Marker、Prime ScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver2试剂盒购自 TaKaRa （大连）公司；RNAperp pure Plant Kit购于北京天根公司；T4 DNA Ligase enzyme、EZNATM Gel Extraction Kit、EZNATM Plasmid Mini Kit I 购自 Promega 公司；Protein Marker、Western Blotting Marker、Ni-IDA 琼脂糖凝胶、鼠抗His单克隆抗体、羊抗鼠多克隆抗体购自德泰生物（南京）有限公司；Bradford 蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

12试验方法

121CSN4的克隆

参照试剂盒说明书提取烟草叶片总RNA，以总RNA为模板采用一步法RT-PCR直接扩增目的片段，回收纯化构建到pGEM-T载体并转化到Ecoli DH5α，经菌落PCR与质粒PCR鉴定为阳性的菌株送至宝生物工程大连有限公司测序。

122目的基因与原核表达载体的构建

应用Primer Premier 5软件设计特异性引物：上游引物5′- CGGAATTCATGGAGAGCGCGTTCGCTAG3′（含EcoRΙ）段，下游引物5′- GCGTCGACTTATCAGACAGGAATAGCG3′（含Sal Ι），PCR 反应程序为 94℃ 4min；94℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 15min，30 个循环；72℃延伸 10min，用EcoR Ι和SalΙ对pET28a和目的基因片段双酶切，胶回收后连接转化到感受态表达宿主菌BL21（DE3），涂布于含50mg/L Kan 的LB培养基，选取菌落PCR与质粒 PCR鉴定为阳性的菌落进行双酶切鉴定。

123重组菌株pET28a-CSN4的诱导表达

挑取单菌落接种到 4mL 含 50mg/ L Kan的LB液体培养基中，180rpm培养至 OD600为05～06时加入终浓度为025mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），分别置于15℃和37℃诱导表达。

124SDS-PAGE检测

取1mL诱导表达的重组菌株培养液，12000rpm 离心1min，去除上清液，加等量PBS 液重懸沉淀，12000rpm 离心1min，沉淀加入100μL SDS-PAGE 2×loading Buffer煮沸10min，12000rpm 离心1min，取15μL上清液上样，100V电泳。

125目的蛋白的纯化及浓度的测定

采用Ni-IDA 亲和层析对目的蛋白进行纯化，经诱导后的全菌用50mM Tris（pH80），150mM NaCl 含 1% Triton X-100，1μg/mL Pepstatin A，1μg/mL Leupeptin 超声裂解（超3s停8s，25min），同时以50mM Tris（pH80），150mM NaCl 缓冲液平衡 Ni-IDA 亲和层析柱，再用不同咪唑浓度的洗脱缓冲液对目的蛋白进行洗脱，收集不同组分进行12% SDS-PAGE 电泳分析，Bradford法测定蛋白浓度。

126Western Blotting 检测目的蛋白

SDS-PAGE电泳鉴定后的胶100V，80min转移至 PVDF 膜上，用5% 脱脂奶粉室温封闭1h，加入鼠抗 His 单克隆抗体作为一抗，室温孵育1h，PBST 缓冲液洗涤4次，每次4min，用羊抗鼠多克隆抗体作为二抗，室温反应1h，PBST 洗涤4次后化学发光显影拍片保存。

2结果与分析

21CSN4的克隆

提取烟草叶片总RNA（见泳道2），一步法RT-PCR扩增目的片段后进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1。1号泳道扩增出多条DNA条带，但箭头处出现与预期大小相符的扩增条带。

胶回收目的DNA并构建至pMD18-T载体，菌落PCR与质粒PCR验证结果见图2。结果表明在12kb处出现了与预期大小一致的特异性扩增条带，测序显示其长度是1194bp，编码398个氨基酸，BLAST比对与番茄CSN4的序列同源性和蛋白同源性分别为94%和96%，说明克隆CSN4基因正确。

242包涵体通过亲和层析纯化CSN4 蛋白

包涵体经洗涤溶解后，用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测，结果见图6。

26蛋白浓度的测定

采用Bradford测定蛋白浓度，以BSA作为标准蛋白质，根据不同浓度在A595的吸光值绘制标准曲线回归方程：Y=12285X2+06871X+00466，R2=09988，目的蛋白样品的浓度达0476mg/mL，为CSN4基因功能研究奠定基础。

3结论与讨论

本研究克隆获得基因CSN4 cDNA序列，基因登陆号为 KC866360序列，构建原核表达载体pET28a-CSN4/ BL21（DE3）并成功表达，纯化包涵体蛋白获得纯度较高的目的蛋白。Western blotting初步证明该融合蛋白就是带有His标签的CSN4蛋白，为后续应用蛋白互作技术验证在转ChIFN-γ烟草中ChIFN-γ调控的信号转导途径中CSN4与ChIFN-γ的关系奠定基础。

基因的转录和翻译在原核表达系统中是同步进行的，当蛋白的翻译速率过快而无充足的时间进行折叠时易堆积在一起形成包涵体[17-18]；另外包涵体的形成还与蛋白本身的性质有关，疏水分布较多更容易形成包涵体。洗涤溶解后的包涵体经His镍柱纯化（咪唑洗脱浓度分别为50、100、500mM），Ni亲和层析柱可对带有His标记的蛋白质特异结合，蛋白在纯化过程中易受到蛋白酶的攻击而降解，SDS-PAGE检测到50、100、500mM浓度的咪唑洗脱液洗脱出来的蛋白都有明显的降解条带，50、100mM咪唑的洗脱出的蛋白浓度没有在500mM咪唑处的蛋白浓度高，在500mM咪唑处可洗脱获得较高浓度蛋白。

ChIFN-γ作为一种动物来源的基因，其在植物体内成功表达，并引起一系列植物表观性状的改变，对ChIFN-γ在植物体中介导的信号转导途径的研究具有重要意义。转ChIFN-γ烟草的抗虫性可能是由于ChIFN-γ激活了多种转录因子，调控与次级代谢物合成相关基因的表达，从而使转基因植物表现出一定的抗虫性。由于ChIFN-γ为动物来源抗病基因，能与动物细胞膜上特定的受体相结合而激活一系列的免疫反应。但转入植物后，转基因植株均表现出一定的抗虫性，所以对ChIFN-γ是否直接作用于目的基因的研究，可进一步阐释其抗虫机制，对促进现代绿色循环农业的高效发展具有重要意义。

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