建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F—02的绿色荧光蛋白基因标记

摘 要：【目的】开展建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02的绿色荧光蛋白标记研究，直观观察尖孢镰刀菌在建兰植株上的侵染为害，明确病原菌的致病过程，为开展建兰茎腐病原菌的相关研究提供良好技术手段。【方法】采用农杆菌介导法对建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02进行绿色荧光蛋白（GFP）转化，并检测转化子的遗传稳定性。【结果】GFP基因可被成功导入到尖孢镰刀菌F-02中并获得表达，转化子在蓝色光源激发下，菌丝和分生孢子均能稳定散发绿色荧光；转化子10次继代培养后菌落生长良好，菌丝和分生孢子仍可稳定散发出绿色荧光，对寄主植物的致病力也未发生改变，【结论】GFP基因可在建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02中稳定存在，并对其致病力没有影响。

关键词：建兰；茎腐病；尖孢镰刀菌；绿色荧光蛋白；基因标记

中图分类号：S 436.8文献标识码：A文章编号：1008-0384（2019）01-70-06

Abstract： 【Objective】Green fluorescent protein（GFP） genetic marker of Fusarium oxysporum F-02 of stem rot disease on Cymbidium ensifolium were conducted in this study in order to observe the inflection of F. oxysporum on C. ensifoliumplants， confirm the process of the pathogen， and provide powerful technic for further studies on F. oxysporum.

【Method】GFP was transformed into F.oxysporum strain F-02 mediated by Agrobacterium， and the genetic stability of GFP in transformants was investigated.【Result】GFP gene can be successfully introduced into F.oxysporum and stable green fluorescence can be produced in the hypha and spores under the excitation of blue light source.After 10 successive transfers， the progenies grew well with stable green fluorescence and similar pathogenicity as parental transfrormant.【Conclusion】GFP gene was inherited stablely in C.ensifolinm and no effect on pathogenicity in F-02 strain.

Key words： Cymbidium ensifolium； stem rot； Fusarium oxysporum； green fluorescent protein； genetic marker

0 引言

【研究意義】由尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum引起的建兰茎腐病是影响福建省建兰种植的最严重真菌病害之一，可引起兰株假鳞茎和根部腐烂、维管束褐变，导致兰株萎蔫至死亡，兰株感病率高达15%～35%[1]。目前对建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的生物学特性已有一些认知[2]，但对该菌的致病机理还缺乏深入研究，因此探讨如何更直观、方便地观察该菌在建兰植株上的侵染、致病过程，对研究该菌在建兰上的致病机理、科学防治建兰茎腐病具有指导意义。【前人研究进展】绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）是一种良好的标记物，其片段小，易于与多种不同蛋白N端或C端融合，表达后对寄主细胞无毒性作用并能自发产生荧光蛋白，可作为报告基因进行定位与定性检测，目前已广泛应用于植物病原菌致病机理的研究[3-5]。现阶段，国内外学者已成功利用GFP基因标记了番茄、香蕉、甜瓜和香石竹等寄主植物上的尖孢镰刀菌[6-10].【本研究切入点】目前尚未见将GFP用于标记建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的研究报道。【拟解决的关键问题】本研究以pCAMBIA1300-ptrpC-hph-gfp为转化载体，农杆菌AGL-1为转化介体，采用农杆菌介导法对建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02进行绿色荧光蛋白（GFP）基因标记，并检测转化子的遗传稳定性，为建兰茎腐病原菌的致病机理研究提供技术手段。

1 材料与方法

1.1 试验材料

建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F.oxysporum野生型菌株 F-02，来源于福建省农业科院学植物保护研究所。转化载体pCAMBIA1300-ptrpC-hph-gfp和转化介体农杆菌AGL-1，来源于福建省农业科学院农业生物资源研究所。抗生素（潮霉素B、卡那霉素、特美汀）购自美国Sigma公司。农杆菌转化所用药品均为分析纯，储存液及MM（Minimal Medium）液体培养基、IM（Induction Medium）液体培养基、CM（Complete Medium）固体培养基的配制见表1。

1.2 农杆菌转化及培养

建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02菌株的GFP基因标记参照Khang和张俊华等[11-12]的方法，略作改动。具体步骤：（1）将菌株F-02在PDA固体培养基上纯化培养6 d，后加入无菌水将分生孢子刮洗后用2层无菌擦镜纸过滤，滤液用IM液体培养基将分子浓度调整到1×106 个·mL-1，备用；（2）将转入pCAMBIA1300-ptrpC-hph-gfp载体的农杆菌AGL-1在MM液体培养基中，28℃及250 r·min-1摇培2 d，后用IM液体培养基将菌液吸光值调整为OD600=0.15，接着摇培6 h（OD600≈0.60）；（3）将混合纤维微孔滤膜[生工生物工程（上海）股份有限公司]放置在CM固体培养基上，将100 μL菌株F-02孢子悬浮液和100 μL农杆菌AGL-1孢子悬浮液轻轻混匀后均匀涂布于混合纤维微孔滤膜上，25℃暗培养2 d；（4）2 d后，将共培养的混合纤维微孔滤膜用无菌解剖刀划成小块，接菌面朝上分散摆放到筛选培养基（含100 μg·mL-1潮霉素B和200 μg·mL-1特美汀的PDA固体培养基）上，28℃暗培养3 d；（5）经筛选培养基上培养后，将培养皿整皿放置在BD-BGC1蓝光切胶仪（上海勤翔科学仪器有限公司）中，在蓝色激发光下观察菌落发光情况，挑选发出绿色荧光的小菌落，取边缘菌丝于无菌水中，按梯度稀释涂布培养3～5 d后，将单一的孢子体转接到PDA固体培养基（含100 μg·mL-1潮霉素B和200 μg·mL-1特美汀）上进行单孢分离与纯化，获得转化子。

1.3 转化子荧光显微镜观察鉴定

将转化子用含100 μg·mL-1潮霉素B和200 μg·mL-1特美汀的PDA固体培养基，28℃培养6 d后，挑取转化子菌丝和分生孢子样品制玻片，在奥林巴斯IX73荧光显微镜下进行观察鉴定以及照相。

1.4 转化子的遗传稳定性测定

随机挑取6个经单孢纯化后的单菌落即转化子，接种于PDA 固体培养基中，28℃培养6 d，选取平皿边缘的菌丝转接到新的PDA固体培养基中，按以上方法连续培养9代，后将第10代接种到PDA固体培养基（含100 μg·mL-1潮霉素B和200 μg·mL-1特美汀）中，观察转化子菌落生长情况；同时挑取转化子的菌丝和分生孢子制成玻片，在荧光显微镜下进行观察鉴定及照相，以野生型菌株F-02为对照。

1.5 转化子的致病力测定

参照许志刚[13]的方法测定转化子的致病力。将野生型菌株F-02和转化子菌株在PDA固体培养基上于28℃活化培养6 d，备用。田间选取叶片和假鳞茎等无伤痕的一年生建兰健康植株，用无菌水轻轻冲洗干净，自然晾干后用于致病性测定。采用造伤接种法进行接种：在植株假鳞茎部用无菌接种针轻轻刺伤，后敷上0.5 cm×0.5 cm待测菌株的菌丝块，用無菌水浸湿的棉花包裹菌丝块保湿，后置于冷光源植物气候箱DRX-400（宁波赛福实验仪器有限公司）中，温度（28±0.5）℃，光周期16 L∶8 D，接菌5、7、15 d后观察发病情况，两处理菌株各接菌5株建兰植株，3次重复，待假鳞茎部产生典型病斑后重新分离病原菌。同时，切取转化子的接种部位进行徒手切片，在奥林巴斯IX73荧光显微镜下选取观察效果佳的玻片，后使用Leica TCS SP5激光共聚焦显微镜进行观察及拍照。

2 结果与分析

2.1 菌株在混合纤维微孔滤膜上的转化情况

建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02孢子悬浮液，在混合纤维微孔滤膜上与农杆菌AGL-1孢子悬浮液共培养2 d后，发生转化，产生少量菌丝和细菌混合物，略呈紫色（图1）。

2.2 菌株转化后在筛选培养基上的生长情况

经转化后的建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02，平贴在筛选培养基（含100 μg·mL-1潮霉素B和200 μg·mL-1特美汀的PDA固体培养基）上，经过28℃暗培养3 d后，在蓝光切胶仪中呈现绿色荧光小菌落，此小菌落即为转化子（图2）。

2.3 转化子的荧光显微镜观察鉴定

转化子的菌丝和分生孢子均能发出稳定的绿色荧光（图3），说明GFP 基因已成功转入到建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02中并获得表达。

2.4 转化子的遗传稳定性测定

6个经单孢纯化后的转化子经10次继代培养，其第10代转化子在PDA固体培养基（含100 μg·mL-1潮霉素B和200 μg·mL-1特美汀）中生长良好，菌落形态和菌丝生长速度与野生型菌株F-02差异不明显，转化子菌丝生长浓密，呈淡紫红色或淡紫白色，说明转化子的潮霉素抗性稳定；同时，通过在荧光显微镜下观察第10代转化子的菌丝和分生孢子，仍能稳定散发出均一的绿色荧光，说明GFP基因已成功转入建兰尖孢镰刀菌F-02菌株中，具有较好的遗传稳定性。

2.5 转化子的致病性测定

建兰接种野生型菌株F-02和转化子菌株，其假鳞茎部在15 d后均表现出茎腐病的典型症状，假鳞茎变褐、腐烂，且2种处理的症状没有明显差异，转化子菌株和野生型菌株的致病力相当；之后，分别从接种发病的建兰假鳞茎上再分离获到性状和分生孢子形态与原接种菌株一致的菌株，根据柯赫氏法则证实分离的病原菌均是建兰茎腐病的致病菌尖孢镰刀菌F.oxysporum。同时，对转化子的接种部位进行切片，通过激光共聚焦显微镜观察发现，转化子菌体可以直接在表皮定殖、扩展并深入细胞间隙，说明GFP的导入对建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02的致病性没有明显影响（图4）。

3 讨论与结论

建兰茎腐病一直以来困扰着建兰的种植。该病发病快，肉眼难以观察到茎腐病发生起始以及扩展的过程，待到田间茎腐病出现症状时再防治为时已晚。因此，了解病原菌在建兰植株上的侵染过程，对探讨建兰茎腐病菌的致病机理、科学防治建兰茎腐病具有指导意义。

绿色荧光蛋白（GFP）是一种良好的标记物，广泛应用于病菌与寄主植物互作研究中[14-15]。农杆菌介导的真菌遗传转化，因其操作简便、转化效率高及易获得单拷贝随机插入的转化子等优点而成为研究植物病原真菌致病相关基因及其致病分子机制的手段之一[16-20]。本研究采用农杆菌介导法成功将绿色荧光蛋白（GFP）转入到建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌F-02中，并获得了表达GFP的转化子，转化子在蓝光光源的激发下，菌丝及孢子均能散发稳定的绿色荧光；转化子经过10次继代培养后，菌丝和分生孢子均能稳定散发出均一的绿色荧光，菌落形态、生长速度和致病力与没转化的野生型菌株差异不明显，遗传稳定性强。该转化子将被应用于建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的致病机理以及防控等方面的研究，为该病原菌提供活细胞可视化检测手段。

参考文献：[1]

YAO J A， HUANG P， LAN C Z， et al.Stem rot on Cymbidium ensifolium （Orchidaceae） caused by Fusarium oxysporum in China[J].Canadian Journal of Plant Pathology， 2018， 40 （1）： 105-108.

[2]姚锦爱， 黄鹏， 陈峰， 等.建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的生物学特性研究[J].福建农业学报， 2018， 33（2）： 190-194.

YAO J A， HUANG P， CHEN F， et al.Biological Characteristics of Fusarium oxysporum， a Pathogen of Stem Rot on Cymbidium ensifolium[J].Fujian Journal of Agricultural Sciences， 2018， 33（2）： 190-194.（in Chinese）

[3]肖荣凤， 朱育菁， 李燕丹， 等.西瓜尖孢镰刀茵FOV-135的绿色荧光蛋白基因转化[J].福建农业学报， 2009， 24（6）： 521-524.

XIAO R F， ZHU Y Q， LI Y D， et al.Green fluorescent protein gene transformation on Fusarium oxysporum f.sp.niveum strain， FOV-135[J].Fujian Journal of Agricultural Sciences， 2009， 24（6）： 521-524.（in Chinese）

[4]BOTTIN A， LARCHE L， VILLALBA F， et al.Green fluorescent protein （gfp） as gene expression reporter and vital marker for studying development and microbe-plant interaction in the tobacco pathogen Phythophthora parasitica var.nicotianae[J].FEMS Microbiology Letters， 1999， 176： 51-56.

[5]WEST P V， REID B， CAMPBELL T A， et al.Green fluorescent protein （gfp） as a reporter gene for the plant pathogenic oomycete Phytophthora palmivora[J].FEMS Microbiology Letters， 1999， 178： 71-80.

[6]NAHALKOVA J， FATEHI J.Red fluorescent protein （DsRed2） as a novel reporter in Fusarium oxysporum f.sp. 1ycopersici [J].FEMS Microbiology Letters.2003， 225： 305-309.

[7]VISSER M， GORDON T R， WINGFIELD B D， et al.Transformation of Fusarium oxysporum f.sp cubense， causal agent of Fusarium wilt of banana， with the green fluorescent protein （GFP） gene[J].Australasian Plant Pathology， 2004， 33： 69-75.

[8]張欣.香蕉枯萎病菌遗传多态性及绿色荧光蛋白基因转化的研究[M].广州： 华南热带农业大学出版社， 2007.

ZHANG X.Studies on Genetic Diversity and Transformation of the Green Fluorescent Protein Gene in Fusarium Oxysporum f.sp. Cubense， Causal Agent of Banana Fusarium Wilt[M].Guangzhou： South China Agicultural University Press， 2007.（in Chinese）

[9]NONOMURA T， TAJIMA H， KITAGAWA Y， et al.Distinguishable staining with neutral red for GFP-marked and GFP-nonmarked Fusarium oxysporum strains sim-ultaneously colonizingroot surfaces[J].Journal of General Plant Pathology， 2003， 69（1）： 45-48.

[10]SARROCCO S， FALASCHI N， VERGARA M， et al.Use of Fusarium oxysporum f.sp.dianthi transformed with marker genes to follow colonization of carnation roots[J].Journal of Plant Pathology， 2007， 89（1）： 47-54.

[11]KHANG C H， PARK S Y， RHO H S， et al.Filamentous fungi （Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum）//Agrobacterium Protocols[M].Totowa： Humana Press， 2007：403-420.

[12]张俊华， 刘烨， 韩雨桐， 等.农杆菌介导稻瘟病菌绿色荧光蛋白（GFP）遗传转化研究[J].东北农业大学学报， 2014， 45（11）： 1-7.

ZHANG J H， LIU Y， HAN Y T， et al.GFP genetic transformation of Magnaporthe grisea mediated by Agrobacterium tumefaciens[J].Journal of Northeast Agricultural University， 2014， 45（11）： 1-7.（in Chinese）

[13]许志刚.普通植物病理学（第4版） [M].北京： 中国农业出版社， 2003：23-25.

XU Z G， General Plant Pathology（4th Edition）[M].Beijing： China Agriculture Press， 2003：23-25.（in Chinese）

[14]許有嫔， 廖海澄， 陈金华， 等.利用绿色荧光蛋白GFP研究稻瘟病菌与水稻的互作[J].植物保护， 2017， 3（6）： 53-61.

XU Y B， LIAO H C， CHEN J H， et al.Fluorescent microscopic analysis of the plant infection process of Magnaporthe oryzae using green fluorescent protein[J].Plant Protection， 2017， 3（6）： 53-61.（in Chinese）

[15]CAI X D， FU J， GUO W W.Mitochondrial Genome of Callus Protoplast Has a Role in Mes ophyll Protoplast Regeneration in Citrus： Evidence From Transgenic GFP Somatic Homo-Fusion[J].Horticultural Plant Journal， 2017， 3 （5）： 177-182.

[16]李二峰， 王殿东， 杨宇红， 等.根癌农杆菌介导甘蓝枯萎病菌的遗传转化[J].中国蔬菜， 2011， 14： 28-34.

LI E F， WANG D D， YANG Y H， et al.Agrobacterium Tumefaciens Mediated Transformation of Cabbage Fusarium Wilt Pathogen[J].China Vegetables， 2011，14： 28-34.（in Chinese）

[17]李敏慧， 张荣， 姜大刚， 等.根癌农杆菌介导的香蕉枯萎病菌4号生理小种的转化[J].植物病理学报， 2009， 39（4）： 405-412.

LI M H， ZHANG R， JIANG D G， et al.Agrobacterium tumefaciens Mediated Transformation of Fusarium oxysporum f.sp. cubense race 4[J].Acta Phytopathologica Sinica， 2009， 39（4）： 405-412.（in Chinese）

[18]任海英， 方丽， 李岗， 等.农杆菌介导的甜瓜蔓枯病菌遗传转化体系的建立[J].生物工程学报， 2010， 26（6）： 802-808.

REN H Y， FANG L， LI G， et al.Transformation of Didymella bryoniae mediated by Agrobacterium tumefaciens[J].Chinese Journal of Biotechnology， 2010， 26（6）： 802-808.（in Chinese）

[19]段学清， 郑莉茹， 刘文波， 等.GFP绿色荧光法辅助筛选玉米转基因植株[J].玉米科学， 2017， 25（2）： 31-38.

DUAN X Q， ZHENG L R， LIU W B， et al.Production of Transgenic Maize Plants via the GFP Green Fluorescence-assisted Selection[J].Journal of Maize Sciences， 2017， 25（2）： 31-38.（in Chinese）

[20]陈春艳， 马晖玲， 董文科， 等.CPB-LAR-GFP表达载体的构建及其在紫花苜蓿愈伤组织中的表达[J].草原与草坪， 2017， 37（2）： 25-30.

CHEN C Y， MA H L， DONG W K， et al.Construction of CPB-LAR-GFP expression vector and its transformation in callus of alfalfa[J]. Grassland and Turf， 2017，37（2）：25-30.（in Chinese）

（责任编辑：林海清）