人泛素结合酶UbcH5c活性突变体的构建·纯化以及催化活性研究

摘要 [目的]构建人泛素结合酶UbcH5c的活性位点突变体S22R和F62A，同时分析这2种突变体蛋白与野生型蛋白在泛素化反应中的活性差异。[方法]通过点突变（Site-Directed Mutagenesis）的方法构建2种突变体质粒，利用0.5 mmol/L IPTG分别诱导2种突变体蛋白在大肠杆菌中进行表达；将菌体超声破碎后，依次利用阳离子交换层析法对UbcH5c突变蛋白进行分离纯化，最后利用体外泛素化酶促反应结合蛋白免疫印迹杂交的方法分析野生型UbcH5c与其活性突变体UbcH5c S22R和UbcH5c F62A在泛素化修饰上的差异。[结果]人泛素结合酶UbcH5c的2个突变体蛋白S22R、F62A的泛素化修饰程度明显弱于野生型蛋白。[结论]突变体S22R和F62A突变均不同程度的改变了人泛素结合酶UbcH5c与泛素分子之间的结合活性，即2个突变的位点中第62位苯丙氨酸残基及第22位丝氨酸残基均是UbcH5c结合泛素的关键位点，而且后者对于UbcH5c结合泛素活性的影响更大。

关键词 UbcH5c；泛素化修饰；点突变

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）03-00663-04

蛋白的泛素化修饰包括以下3个步骤：（1）泛素的活化：泛素甘氨酸端的羧基连接到泛素活化酶E1（Ubiquitin activating enzyme）的巯基，这个步骤需要以ATP作为能量，最终形成一个泛素和泛素活化酶E1之间的硫酯键；（2）E1将活化后的泛素通过交酯化过程交给泛素结合酶E2（Ubiquitin conjugating enzyme）；（3）泛素连接酶E3将结合在E2上的泛素分子连接到底物蛋白上，最终，底物蛋白被泛素化修饰[1-3]。UbcH5c是泛素结合酶（ubiquitin-conjugating enzyme，E2）家族中的成员，由147个氨基酸构成，分子量约为16 kDa[4]。在泛素介导的泛素化反应途径中泛素活化酶（E1）将活化后的泛素分子通过交酯化过程呈递给UbcH5c，泛素分子结合于UbcH5c的第85位半胱氨酸（Cys85）形成UbcH5c-Ub复合物，其中Cys85是UbcH5c的活性催化中心的氨基酸[5]。研究发现，在泛素化級联反应中，除了UbcH5c通过巯酯键与泛素分子之间形成复合物以外，其他的氨基酸在该复合物的形成过程中也发挥重要作用，例如第22位的丝氨酸（Ser，S）和第62位的苯丙氨酸[6]。笔者通过点突变（Site-Directed Mutagenesis）的方法分别构建2种UbcH5c的活性突变体UbcH5c S22R、UbcH5c F62A；其中，UbcH5c S22R为野生型UbcH5c的氨基酸序列上第22位的丝氨酸（Ser，S）改变为精氨酸（Arg，R）；UbcH5c F62A为野生型UbcH5c的氨基酸序列上第62位的苯丙氨酸（Phe，F）改变为丙氨酸（Ala，A）；并利用体外泛素化酶促反应与蛋白免疫印迹的方法分析野生型UbcH5c及其2个突变体在泛素化反应中活性的差异，以期为UbcH5c活性突变体的的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株和质粒载体。感受态大肠杆菌E.coli Trans10、E.coli BL21（DE3）、重组质粒pET21a-UbcH5c，由实验室保存。

1.1.2 主要试剂。Vent DNA polymeras，购自美国NEB公司；T4 DNA连接酶，购自美国 Promega公司；PVDF膜，购自德国Milipore公司；质粒小提中量试剂盒，购自北京天根公司；鼠源UbcH5c单克隆抗体，购自Abcam公司；鼠源HRP偶联抗体，购自Promega公司；ECL化学发光底物试剂盒，购自Thermo Scientific；其他试剂为国产分析纯，市售。

1.2 方法

1.2.1 人泛素结合酶UbcH5c点突变体的构建。人泛素结合酶UbcH5c突变体的构建采用Site-directed Mutagenesis Kit 的方法，即根据NCBI数据库公布的人泛素结合酶UbcH5c的基因编码序列（GenBank号为U39318.1）分别设计2对互补的引物（如表1所示）构建突变体质粒[5]。质粒构建采用PCR的方法，反应条件为 94 ℃，6 min；94 ℃，30 s，78 ℃，30 s，72 ℃，10 min，16个循环；72 ℃，15 min。取20 μl PCR产物利用DpnI于37 ℃下酶切1 h，酶切后的产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增成功，再将酶切产物转化到大肠杆菌Trans 10 感受态细胞中，涂布于含Ampr的LB平板上，37 ℃条件下培养12～16 h。挑取单个菌落接种于含Ampr的LB液体培养基中，37 ℃条件下150 r/min振荡培养过夜，提取质粒后进行测序验证。

2.4 人泛素结合酶UbcH5c及其2种突变体UbcH5c S22R、UbcH5c F62A泛素结合活性分析 图6表明，野生型UbcH5c具有最强的泛素结合活性，其UbcH5c-Ub复合物的生成量最多。相比之下，突变体UbcH5c S22R的泛素结合活性明显弱于野生型UbcH5c，且生成的UbcH5c-Ub复合物也偏少。而突变体UbcH5c F62A的泛素结合活性几乎完全丧失，不能够与泛素分子之间形成UbcH5c-Ub复合物。结果表明，人泛素结合酶UbcH5c中第22位的丝氨酸与第62位的苯丙氨酸的单独突变均明显削弱了UbcH5c与泛素分子的结合活性；且与第22位的丝氨酸相比，第62位的苯丙氨酸位点对于其与泛素分子结合至关重要。

3 结论与讨论

试验利用定点突变的方法构建了人泛素结合酶UbcH5c的2株突变体蛋白，分别为S22R和F62A。通过与野生型蛋白进行比较发现，S22以及F62的突变直接导致UbcH5c与泛素分子之间非共价结合作用明显降低，表明这2个位点与UbcH5c和泛素分子之间非共价结合直接相关。泛素结合酶是泛素化修饰途径中的核心组件之一，且可以将活化的泛素分子从泛素活化酶上转移到特定的泛素连接酶上[7-9]。研究表明，人泛素结合酶UbcH5c与泛素的结合包括2种方式，一种为其第85位的半胱氨酸与泛素分子的共价结合，另一种为其与泛素分子的非共价结合。人泛素结合酶UbcH5c与泛素分子的非共价结合对泛素的成链具有重要作用，为了研究人泛素结合酶UbcH5c与泛素分子之间的非共价结合。Brzovic等在蛋白质的分子水平上，利用核磁共振成像等手段对人泛素结合酶UbcH5c与泛素通过非共价结合形成的复合物进行了研究[6]。结果表明，人泛素结合酶UbcH5c可以识别并非共价的结合泛素分子上第8位的亮氨酸、第44位的异亮氨酸以及第70位的缬氨酸，这种与泛素分子之间非共价的结合主要集中在人泛素结合酶UbcH5c上远离其半胱氨酸（Cys85）残基的β折叠链1-3上，其中距离最近的非共价结合位点也超过了20个氨基酸的长度，且一个泛素分子不能同UbcH5c Cys85残基以及非共价结合位点同时结合。当UbcH5c的非共价结合位点S22与F62被突变后，人泛素结合酶UbcH5c的泛素化修饰程度变得异常微弱与缓慢。

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