变应性鼻炎大鼠血清内源性Ｈ２Ｓ及ＮＯ表达水平变化研究

[摘要] 目的 观察变态反应性鼻炎SD大鼠血清内源性硫化氢(H2S)、一氧化氮(NO)表达水平变化,并探讨其意义。方法 20SD大鼠只随机分为空白对照组、模型组,用甲苯-2,4-二异氰酸酯建立变应性鼻炎大鼠模型,用敏感硫电极法检测血清H2S水平,酶法检测血清一氧化氮水平,进行对比分析。结果 对照组血清内源性H2S:3.01μmol/L,NO:38.4μmol/L,模型组血清内源性H2S:4.25μmol/L,NO:46.2μmol/L,对照组低于模型组,具有统计学意义(P<0.05)。结论 变态反应性鼻炎大鼠血清内源性H2S、NO表达水平增高,可能对鼻粘膜的变态反应性炎症起到调节作用,起到保护鼻粘膜的作用。

[关键词] 硫化氢;一氧化氮;变应性鼻炎

[中图分类号] R765.22[中图分类号] A[文章编号] 1673-9701(2009)24-47-02

H2S和NO是机体内正常表达的气体信号分子,具有广泛的生理作用,并对机体免疫功能,炎症反应等具有调节作用,有研究表明[1],在变态反应性鼻炎时NO及INOS表达会发生改变,参与变态反应性鼻炎的发病及调节,本文就变态反应性鼻炎大鼠血清H2S和NO表达水平变化进行研究,并探讨其机制及意义。

1资料与方法

1.1主要仪器及试剂

甲苯-2,4-二异氰酸酯(Toluene 2, 4-diisocyanate, 2, 4- TDI)(美国Sigma公司),橄榄油(中国医药集团上海试剂公司),水合氯醛(北京化学试剂公司),721型分光光度计(上海精密仪器仪表有限公司),敏感硫电极(PAG/SI上海雷磁),离心机3K30型(德国Sigma公司),硫氢化钠(南京建成生物工程研究所),抗坏血酸南京建成生物工程研究所),乙二胺四乙酸(南京建成生物工程研究所)。

1.2实验动物分组与模型建立

30只健康SD大鼠,(购自郑州大学医学院实验动物中心)6～8周龄,体重(200±25)g,雄性,随机数字表发分为两组,对照组、造模组,用橄榄油将2,4-TDI配成浓度为10%溶液作为致敏剂滴鼻,每侧5μL,每日1次,共致敏7次。此后每2日1次,共致敏4次,致敏时间共15d。从第1次给药开始记录鼻部症状如鼻痒(致敏动物用前爪抓鼻)、喷嚏、清涕,评分,叠加分数,记总分。总分超过5分者模型成功,②激发:致敏结束、模型成功后每2天用10% 2,4-TDI溶液滴鼻,激发1次,维持症状。鼻部症状评分标准[2]:①鼻痒:轻度,轻擦鼻几次,1分;重度,抓挠鼻、面不止,到处擦磨,2分;②喷嚏:1～3个1分,4～10个2分,11个以上3分;③流清涕:流至前鼻孔1分,超过前鼻孔2分,流涕满面3分。对照组给药方法,药品为单纯橄榄油。

1.3标本采集

最后一次激发24h后腹腔注射10%水合氯醛(0.6g/kg)麻醉小鼠,麻醉后经中线无菌开胸,剪开心包膜,打开心脏,取血2mL,于4℃2000r/min低温离心10min,取血清保存于-70℃深低温冰箱待测。

1.4血清内源性H2S检测

采用敏感硫电极法:配制标准硫离子溶液浓度分为1mol/L,分别稀释至1、10、20、30、40、50、60、80μmol/L,测定S离子浓度后绘制标准曲线,血清中加入抗氧化液使H2S、NaTris生成S2-,每次测定前将敏感硫电极及试管用去离子水冲洗3次,将敏感硫电极与参比电极一起浸入到样品中,测定血清H2S浓度,待读数稳定后纪录,再根据标准曲线计算出H2S的浓度。

1.5血清NO检测

采用硝酸银还原酶法:在标准管及样品管依次加入操作步骤:空白管加0.1mL双蒸水,标准管加0.1mL标准液,样品管加0.1mL血清,各管加0.1mL缓冲液,0.1mL硝酸还原酶,37℃孵育30min。加显色剂A 0.5mL,显色剂B 30.5mL,室温静置10min, 550mn比色,空白管调零,测定各管A值,按说明书给定公式计算NO浓度(测定过程严格按照说明书操作)。

1.6统计学处理

数据的统计及分析使用SPSS11.5软件,实验结果以均数±标准差(χ±s)表示,统计学方法采用方差分析。

2结果

模型组H2S及NO浓度同向升高,同对照组相比,具有显著差异(P<0.05)。见表1。

3讨论

H2S及NO是近年来相继发现的气体信号分子,对机体的生理功能具有广泛的调节作用,在肝脏疾病,心血管疾病,神经系统疾病中扮演着重要角色,近年来发现,H2S及NO对疾病状态下机体的免疫功能及炎症反应起着调节作用,NO能直接介导趋化中性粒细胞及对内皮诱发的血管收缩发挥反馈调节作用,而抑制内皮素的生物合成,抑制肥大细胞增殖,脱颗粒,调节肥大细胞释放多种介质[3]。NO活化无活性的GTP环化酶,致cAMP/ cGMP比值下降,能触发过敏细胞释放递质,导致过敏症状的发生[4]。NO可抑制嗜酸性粒细胞(eosinophile granulocyte,EOS)的程序性死亡,引起EOS及其释放的炎症介质的聚集,从而加重及延长了变态反应的程度及时间[5]。变应性鼻炎时Thl激活产生大量NO,抑制其自身细胞因子的产生及增殖,形成负反馈环,从而限制自身激活增殖,对Thl/Th2的平衡具有调节作用[6]。H2S在炎症反应中具有明显的抑制多形核中性白细胞聚集、减轻内毒素引起的肺水肿和肺毛细血管通透性增高等炎症反应的作用,而且能有效减少丙二醛的产生,可能为一种炎症抑制因子[7]。在本组试验中,模型组H2S与NO较对照组明显升高,与周卫东在试验中观察到的NO变化一致,推测可能与变态反应性鼻炎后及鼻粘膜诱导型一氧化氮合酶表达增强有关[1],其次变应性鼻炎时TH1细胞的增量上调,可能促进了NO的合成,H2S主要由胱硫醚-β-合成酶(cystanthionine-β- synthetase,CBS)与胱硫醚-γ-裂解酶(cystanthionine-γ-splitting enzyme,CES)合成,目前尚未见关于CBS、CES在鼻粘膜表达的报道,其增高可能与变应性鼻炎时局部的微循环改变及炎性介质的释放引起H2S表达上调有关,在变应性鼻炎时NO表达增高能促进炎症介质的释放,介导过敏反应,H2S的表达上调,可能与NO表达上调有关[8],抑制局部的炎症及过敏反应,维持气体信号的表达及作用平衡,其具体机制及其对鼻粘膜产生的作用有待进一步研究。

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(收稿日期:2009-03-02)