玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因的克隆及序列分析
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'jh"v q jZ+(*'r[Ӆ<( ek+!jzzy֧v^jh"v q(u[^ { jw\{Zwibr ږȭz
+vVh2^' }wfr+?t-ӝ:`1l-B߀ .##.ߟ. 材料与方法
1.1 材料 供试材料为玉米（Zea mays）品种SC704，种植于新疆农业科学院核技术生物技术研究所。
1.2 试剂
Trizol、大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α感受态购自TIANGEN公司，M-MLV RTase cDNA试剂盒、Ex Taq均购自TaKaRa公司，T4 DNA连接酶、TA克隆载体pGEM-T Easy购自promega公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Omega公司，其余试剂为进口或国产分析纯。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，测序服务由北京华大提供。
1.3 方法
1.3.1 玉米总RNA提取。
在光照充足的中午，取玉米叶片迅速置于液氮中研磨，使用Trizol提取总RNA。提取完成后，参照M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit程序合成cDNA。
1.3.2 PEPC基因扩增。
根据GenBank的玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因的cDNA序列，设计一对引物，即P1：5′-AGATCTGCAGATCTGCTCCAACCATCTCGCTTCCGTG-3′，P2：5′-CTTAAGGGCACGTGGCCGCCTAGCCAGTGTT-CTGCAT-3′。PCR反应程序：98 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，30个循环；72 ℃延伸7 min。
1.3.3 PEPC基因克隆测序。
PCR产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，将得到的目的条带切下，使用凝胶回收试剂盒回收DNA，然后连接到pGEM-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞进行蓝白斑筛选，经菌液PCR与酶切鉴定，送北京华大测序。
1.3.4 PEPC序列生物信息学分析。
测序结果通过NCBI ORF Finder、BLAST及ProParam程序进行在线比对，确定序列完整编码框，并对蛋白质的基本理化性质进行预测；使用TMHMM和SPORT分析蛋白质跨膜结构域并预测其亚细胞定位；采用ProtScale分析蛋白的疏水性/亲水性；利用在线工具 PHD预测蛋白质的二级结构；Smart分析该酶的功能结构域；ProtFun分析蛋白质功能；最后使用PROSITE分析多肽链的催化位点。
2 结果与分析
2.1 玉米PEPC基因的克隆
以玉米总RNA为模板进行RT-PCR，将扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，结果发现，在3 kb左右处有特异性条带（图1），与已知PEPC基因的cDNA全长接近，回收目的片段并构建克隆载体进行测序。
2.2 玉米PEPC基因的核酸与蛋白质序列
测序结果使用Contig Express进行拼接，然后在NCBI 上使用ORF Finder查找其开放阅读框并进行BLAST，再利用ProtParam[6]软件分析其氨基酸序列的理化性质。玉米PEPC 开放阅读框的长度为2 913 bp，GC含量为62.1%；BLAST结果显示，核酸序列与玉米PEPC（NM_001111948）最大相似性达99%；氨基酸序列与玉米PEPC（NP_001105418.1）最大相似性为99%；
其编码的多肽大小为109.31 ku；理论等电点为5.73；含量最高的氨基酸为Leu、Glu和Ala，不含有Pyl和Sec；负电荷残基总数（Asp+Glu）为137个，正电荷残基总数（Arg+Lys）为119个；不稳定指数约为44.65，推测其为不稳定蛋白；脂溶指数为89.48；亲水性系数为-0.337，推测玉米PEPC为亲水性蛋白质。
2.3 玉米PEPC跨膜结构域的预测和分析
TMHMM2.0 Server程序分析表明，玉米PEPC整条肽链都位于膜外，不存在跨膜结构域。使用PSORT对其亚细胞定位进行预测，结果显示，其可能定位于细胞质。
2.4 玉米PEPC的疏水性/亲水性预测和分析
通过Protscal程序对玉米PEPC序列的疏水性/亲水性进行分析，结果见图2。由图2可知，PEPC整条多肽链中亲水性氨基酸均匀分布，且多于疏水性氨基酸，绝大多数氨基酸分值<0。整条多肽链表现为亲水性，即PEPC属于亲水性蛋白，这与其基本理化性质的预测结果一致。表明玉米PEPC中并无明显的疏水区，推测其中可能不存在跨膜蛋白，这也与跨膜结构域的预测和分析结果一致。
2.5 玉米PEPC二级结构预测与分析
通过PHD软件预测和分析玉米PEPC氨基酸序列的二级结构[7-9]，结果见图3。由图3可知，玉米PEPC二级结构主要由α-螺旋（61.44%）、
无规则卷曲（34.43%）和延伸链（4.12%）组成，α-螺旋和无规则卷曲均匀分布于整条肽链，而延伸链则较为集中地分布于多肽链中段。
2.6 玉米PEPC功能结构域预测与分析
使用SMART[10-11]序列分析软件对玉米PEPC氨基酸序列的功能结构域进行分析，结果见图4[7-9]。由图4可知，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的功能结构域由位于175～970位的796个氨基酸组成。使用ProtFun[12]预测玉米PEPC的功能，结果表明，其最主要的功能是参与氨基酸生物合成，此外，还可能参与脂肪酸代谢、蛋白质翻译、辅因子的生物合成以及其他中间代谢过程。
2.7 玉米PEPC Motifs预测和分析
利用ScanProsite[6]对玉米PEPC氨基酸序列进行预测和分析，结果表明，其在173～184、597～609位氨基酸处具有2个磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性位点。此外，该多肽链还具有13个蛋白激酶C磷酸化位点（Protein kinase C phosphorylation site），12个酪蛋白激酶II磷酸化位点（Casein kinase II phosphorylation site），14个N-豆蔻酰化位点（N-myristoylation site），1个cAMP和cGMP依赖蛋白激酶磷酸化位点（cAMP-and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site），3个N-糖基化位点（N-glycosylation site），1个酰胺化位点（Amidation site）（表1）。
3 讨论
与主要粮食作物小麦、水稻等C3植物相比，玉米等C4植物具有CO2补偿点低、几乎无光呼吸等优点，尤其是在高温、干旱、强光等条件下，C4植物具有明显的生长优势及水分利用率[13-14]，同时兼具较高的水分和氮素利用率以及光合作用效率，干物质产量较高[1]。因此，人们一直努力通过各种方式使C3植物具备C4植物的光合特性，以提高其光合作用效率，从而达到大幅增加产量的目的。以前人们通过C3、C4植物杂交，希望C3植物能够获得C4植物同化CO2的高效特性，但效果并未达到预期[15]。近几年随着基因工程技术的发展，将C4光合途径转入C3植物取得了较大突破，在小麦中高粱PEPC基因能够高效表达[16]，高粱、玉米的PEPC基因显著提高了水稻的光合效率[17-18]。但在双子叶植物烟草中甘蔗和玉米的PEPC基因不能高效表达[19]，表明C4基因在C3植物中的表达受种系发生距离的影响。
在C4光合作用途径的所有酶中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是最重要的酶之一[20]。在Mn2+或Mg2+存在的情况下，它催化磷酸烯醇式丙酮酸羧化为草酰乙酸，然后草酰乙酸转化为苹果酸，同时释放出CO2和丙酮酸，丙酮酸再转化为磷酸烯醇式丙酮酸。该研究克隆的玉米PEPC基因所编码的蛋白包含970个氨基酸，通过SMART对其编码的氨基酸序列进行功能域分析，结果表明，该序列175～970位氨基酸组成了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的功能结构域，且在173～184、597～609位具有2个磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性位点，推测其具备磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的催化活性。
人们在Hydrilla verticillata[21-22]和Bienertia cycloptera（Chenopodiaceae）[23]中进一步研究证实C4循环和C3循环能够在单细胞内完成，表明植物的光合代谢存在多种类型。研究发现，逆境条件（如盐害[24]、干旱[25-27]、低温[28-30]及营养胁迫[30]等）会改变不同类型光合酶在不同作物或不同器官的表达模式。因此，推断PEPC除与光合作用直接相关外，还可能在抗逆生理上发挥作用。PEPC的功能多效性对于提高作物光合作用以及抗逆性具有重要意义，有待于进一步研究。
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