保加利亚乳杆菌N-乙酰胞壁质酶基因的克隆及生物信息学分析

材料与方法

1.1 试验菌株和载体

德氏乳杆菌保加利亚亚种MN株，由笔者所在实验室分离、鉴定和保存;pMD19-T克隆载体，购自宝生物工程（大连）有限公司;大肠杆菌DH5α感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 主要试剂

Dream Taq DNA聚合酶、限制性内切酶Nde Ⅰ和Hind Ⅲ，为美国Thermo公司产品;细菌基因组DNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒，为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.3 引物合成

根据GenBank中保加利亚乳杆菌ATCC 11842（NC_008054.1）的基因组序列，应用Primer primer 5.0设计N-乙酰胞壁质酶基因的特异引物，由铂尚生物技术（上海）有限公司合成。上游引物：5′-GGAGCACCATATGATGGCTGGACACAGAAA-3′，下游引物：5′-CGCGGATCCTTAATTATCGTACTTATTCAGGTTG-3′。在上、下游引物的5′端分别引入Nde Ⅰ和BamHⅠ 2个酶切位点（分别为CATATG、GGATCC）。该引物扩增具有完整开放阅读框（ORF）的N-乙酰胞壁质酶基因片段，预计扩增片段长度为676 bp。

1.4 目的基因的扩增与克隆

用细菌基因组DNA提取试剂盒提取保加利亚乳杆菌MN株的基因组DNA作为PCR模板。PCR反应体系：5 μL 10×buffer，1 μL dNTPs（10 mmol/L），各2 μL上、下游引物（10 μmol/L），3 μL模板DNA，0.25 μL Dream Taq DNA聚合酶，加无菌水至50 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，34个循环;72 ℃ 延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，将目的片段与pMD19-T载体连接，并转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆进行培养，提取质粒后进行PCR及双酶切鉴定，将阳性质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。所有试验于2017年在山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室完成。

1.5 序列比对分析

利用DNA Star软件对已经获得的N-乙酰胞壁质酶基因序列片段进行拼接，并推导其氨基酸序列;运用Megalign程序对MN株及GenBank中已发表的10株保加利亚乳杆菌的该基因序列进行比对分析，运用MEGA 4软件绘制系统进化树。

1.6 Mur蛋白的生物信息学分析

用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白质氨基酸序列的理化特性;用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测蛋白质的跨膜区和跨膜方向;用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析蛋白质的信号肽;用ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）分析蛋白质的亲疏水性;用NetPhos 3.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析蛋白质的磷酸化位点;用Hopfield HNN（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_hnn.html）預测蛋白质的二级结构;用Smart（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析预测蛋白质氨基酸序列的保守结构域;用Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）预测蛋白质的三级结构。

2 結果与分析

2.1 目的基因的克隆与鉴定

以保加利亚乳杆菌MN株基因组DNA为模板，PCR扩增N-乙酰胞壁质酶基因。由图1可以看出，电泳检测可见 676 bp大小的条带，与预期目的基因的片段大小相符。将该基因片段与pMD19-T载体连接并转化到DH5α感受态细胞中后，提取重组质粒pMD19-T-mur，PCR能扩增出676 bp大小的目的基因片段，双酶切重组质粒可切出663 bp大小的目的片段和2 692 bp大小的载体片段（图2），表明克隆的 N-乙酰胞壁质酶基因已成功插入pMD19-T载体中。

2.2 基因序列分析

测序得到的MN株N-乙酰胞壁质酶基因的核苷酸序列见图3，将该序列与GenBank中10株保加利亚乳杆菌的相应基因序列进行比对分析，结果表明，核苷酸同源性达到 98.8%～100%。用MEGA 4绘制系统进化树，由图4可以看出，MN株与CNCM I-1519株、LBVIB27株之间的亲缘关系最近。

2.3 MN株N-乙酰胞壁质酶的生物信息学分析

2.3.1 蛋白质的理化特性 用ProtParam针对蛋白质的基本理化特性进行分析，结果显示，MN株N-乙酰胞壁质酶含有217个氨基酸，分子质量为24 546.17 u，理论等电点（pI值）为9.83;该蛋白质由20种氨基酸组成，其中丙氨酸（Ala）和赖氨酸（Lys）含量最丰富，均达到10.1%;总带正电荷残基、带负电荷残基数分别是33、16个;不稳定指数为33.04，被分类为稳定蛋白质;脂肪族系数为85.02; 其总平均疏水指数为

-0.461，为亲水性蛋白。

2.3.2 蛋白质的跨膜结构分析 用TMHMM 2.0软件预测N-乙酰胞壁质酶的跨膜结构，结果显示，该蛋白质由内向外存在1个可能的跨膜螺旋区域（16～38 aa），N端的1～15 aa区域为胞内区，C端的39～217 aa区域为胞外区（图5）。

2.3.3 蛋白质的信号肽预测 用SignalP 4.1进行N-乙酰胞壁质酶的信号肽预测分析，由图6可以看出，该蛋白质不包含信号肽。

2.3.4 蛋白质的亲疏水性分析 用ProtScale分析N-乙酰胞壁质酶的亲疏水性，如图7所示，该蛋白质氨基酸序列绝大多数为亲水性残基（正值表示疏水，负值表示亲水），具有多个高亲水性区域，表明该蛋白质为水溶性蛋白。

2.3.5 蛋白质潜在的磷酸化位点分析 用NetPhos进行磷酸化位点分析，由图8可以看出，N-乙酰胞壁质酶有10个丝氨酸（Ser）、9个苏氨酸（Thr）、7个酪氨酸（Tyr）位点，可能成为蛋白激酶的磷酸化位点。

2.3.6 蛋白质的二级结构预测 用Hopfield HNN预测 N-乙酰胞壁质酶的二级结构，由图9可以看出，该蛋白质含有的 α- 螺旋（用h表示）占55.76%，无规则卷曲（用c表示）占32.72%，延伸链（用e表示）占11.52%。

2.3.7 蛋白质的保守结构域分析 Smart软件分析结果显示，N-乙酰胞壁质酶蛋白质的16～38位氨基酸残基是跨膜区，56～216位氨基酸残基是LYZ2结构域（图10）。

2.3.8 蛋白质的三级结构预测 用Phyre2软件在线预测 N-乙酰胞壁质酶的三级结构，图11结果显示，其序列与c5t1qB模板的同源性最高，基于该模板预测的168个残基（77%的序列）已被建模，可信度达到100%。

3 讨论

乳酸菌的自溶现象普遍存在，大量研究表明，肽聚糖水解酶在菌体自溶中发挥着重要作用[4，9]。不同乳酸菌所含关键肽聚糖水解酶的种类存在差异，植物乳杆菌WCFS1和干酪乳杆菌ATCC 27092的关键肽聚糖水解酶是N-乙酰氨基葡萄糖苷酶[10-11]，而保加利亚乳杆菌LJJ的关键肽聚糖水解酶是N-乙酰胞壁质酶[2]，这2种酶均是细菌中普遍存在的肽聚糖水解酶[12]。

N-乙酰胞壁质酶俗称溶菌酶，是一种无毒、无害、安全性很高的盐基水解蛋白酶，已被广泛应用于食品、饲料、医药等行业[13-15]。该酶专一性地作用于肽聚糖的N-乙酰胞壁酸与N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1，4糖苷键，使细胞溶解死亡。目前，已被证实能够水解肽聚糖的溶菌酶有4类：鸡蛋白溶菌酶、鹅蛋白溶菌酶、噬菌体T4溶菌酶和拟内串生孢霉（Chalaropsis）溶菌酶，尽管这4类酶的基因序列差异很大，但它们的三维结构显示出一些有趣的相似性[12]。

保加利亚乳杆菌N-乙酰胞壁质酶的基因序列与上述酶的基因序列不同。本研究成功克隆了保加利亚乳杆菌MN株的N-乙酰胞壁质酶基因序列，该基因全长654 bp，与其他保加利亚乳杆菌菌株的核苷酸同源性达到98.8%～100.0%。系统进化树分析结果表明，其与CNCM I-1519株、LBVIB27株之间的亲缘关系最近。该基因编码217个氨基酸，应用生物信息学软件分析其基因的结构特征及编码蛋白的功能发现，该蛋白的分子质量为24 546.17 u，理论等电点为9.83;该基因编码蛋白不包含信号肽，但由内向外存在1个可能的跨膜螺旋区域（16～38 aa）;该基因编码蛋白具有多个高亲水性区域，为水溶性蛋白;该基因编码蛋白可能存在10个丝氨酸、9个苏氨酸和7个酪氨酸磷酸化位点;蛋白的二级结构以 α-螺旋为主，且保守域56～216位氨基酸残基是LYZ2结构域;Phyre2软件成功模拟出了该蛋白的三级结构，为探索该蛋白的结构和功能奠定了基础。本研究结果为开展N-乙酰胞壁质酶基因的功能改造和保加利亚乳杆菌自溶活性的改造提供了理论依据。

参考文献：

[1]白卫东，赵文红，梁桂凤，等. 保加利亚乳杆菌的特性及其应用[J]. 中国酿造，2009，209（8）：10-14.

[2]Pang X Y，Cui W M，Liu L，et al. Gene knockout and overexpression analysis revealed the role of N-acetylmuramidase in autolysis of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Ljj-6[J]. PLoS One，2014，9（8）：e104829.

[3]Frirdich E，Gaynor E C. Peptidoglycan hydrolases，bacterial shape，and pathogenesis[J]. Current Opinion in Microbiology，2013，16（6）：767-778.

[4]Rice K C，Bayles K W. Molecular control of bacterial death and lysis[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews，2008，72（1）：85-109.

[5]崔文明，刘 鹭，张书文，等. 保加利亚乳杆菌LJJ自溶的影响因素分析[J]. 食品与发酵工业，2013，39（7）：6-12.

[6]李艾黎，邓凯波，霍贵成. 环境因素对酸奶菌株自溶的影响[J]. 微生物学通报，2008，35（8）：1262-1267.

[7]Lortal S，Chapot-Chartier M P. Role，mechanisms and control of lactic acid bacteria lysis in cheese[J]. International Dairy Journal，2005，15（6/8/7/9）：857-871.

[8]Hickey D K，Kilcawley K N，Beresford T P，et al. Starter strain related effects on the biochemical and sensory properties of Cheddar cheese[J]. The Journal of Dairy Research，2007，74（1）：9-17.

[9]Ostlie H M，Vegarud G，Langsrud T. Autolysis of propionibacteria：detection of autolytic enzymes by renaturing SDS-PAGE and additional buffer studies[J]. International Journal of Food Microbiology，2007，117（2）：167-174.

[10]Rolain T，Bernard E，Courtin P，et al. Identification of key peptidoglycan hydrolases for morphogenesis，autolysis，and peptidoglycan composition of Lactobacillus plantarum WCFS1[J]. Microbial Cell Factories，2012，11（1）：137.

[11]Senba M，Kashige N，Nakashima Y，et al. Cloning of the gene of beta-N-acetylglucosaminidase from Lactobacillus casei ATCC 27092 and characterization of the enzyme expressed in Escherichia coli[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin，2000，23（5）：527-531.

[12]Vollmer W，Joris B，Charlier P，et al. Bacterial peptidoglycan （murein） hydrolases[J]. FEMS Microbiology Reviews，2008，32（2）：259-286.

[13]杨 兵，李晓凤，夏先林. 牛膝多糖对断奶仔猪氧化应激和免疫功能的影响[J]. 江苏农业学报，2017，33（3）：618-623.

[14]陈珊珊，丁 健，李 鑫，等. 整体优化的信号肽和人溶菌酶基因在毕赤酵母的高效表达[J]. 江苏农业学报，2018，34（1）：20-28.

[15]何金花，劉 誉，刘冠杰，等. 溶菌酶在医药中的应用及其研究进展[J]. 今日药学，2008，18（2）：16-19.徐 敏，徐 乐，巫丽君，等. 江苏省水稻产量结构变化特征及与综合气候适宜度的关系[J]. 江苏农业科学，2019，47（15）：103-108.