胃癌组织中FHIT、Bcl-2蛋白表达与幽门螺杆菌感染的关系

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[摘要] 目的 探讨胃癌组织中脆性组氨酸三联体（FHIT）、Bcl-2蛋白表达与幽门螺杆菌（Hp）感染的关系。 方法 收集2013年1月～2017年1月于解放军第四六四医院行胃癌根治术的80例胃癌组织标本，另选其中43例癌旁组织。采用快速尿素酶试纸和Warthin-Starry染色，检测组织标本是否感染Hp，采用免疫组化染色方法检测组织标本中FHIT和Bcl-2的表达。 结果 胃癌组织FHIT阳性表达率低于癌旁组织（P < 0.05），胃癌组织Bcl-2阳性表达率高于癌旁组织（P < 0.05）。胃癌组织中FHIT的表达与淋巴转移、远处转移、分化程度、浸润程度和Hp感染均有关（均P < 0.05），Bcl-2的表达与肿瘤直径、分化程度、浸润程度和Hp感染有关（均P < 0.05）。FHIT的阳性率与Hp感染呈负相关（r = -0.295，P < 0.05），Bcl-2的阳性率与Hp感染呈正相关（r = 0.393，P < 0.05）。 结论 胃癌组织中FHIT蛋白表达减弱，Bcl-2蛋白表达增强，且均与Hp感染关系密切，三者相互作用导致了胃癌的发生。

[关键词] 胃癌;幽门螺杆菌;脆性组氨酸三联体;Bcl-2

[中图分类号] R735.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）02（b）-0100-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between fragile histidine triad （FHIT） and Bcl-2 protein expression in gastric cancer tissues and helicobacter pylori （Hp） infection. Methods From January 2013 to January 2017， 80 gastric carcinoma tissue samples were collected after radical gastrectomy in the 464th Hospital of PLA， and 43 paracancerous tissues were selected. Rapid urease assay paper and Warthin-Starry staining were used to detect whether the tissue samples were infected with Hp， and the expressions of FHIT and Bcl-2 in the tissue samples were detected by immunohistochemical staining. Results FHIT positive expression rate in gastric carcinoma tissues was lower than that in para-carcinoma tissues （P < 0.05）， Bcl-2 positive expression rate in gastric carcinoma tissues was higher than that in para-carcinoma tissues （P < 0.05）. The expression of FHIT in gastric carcinoma tissues was related to lymphatic metastasis， distant metastasis， degree of differentiation， degree of infiltration and Hp infection （all P < 0.05）. Bcl-2 expression was related to tumor diameter， differentiation degree， infiltration degree and Hp infection （all P < 0.05）. The positive rate of FHIT was negatively correlated with Hp infection （r = -0.295， P < 0.05）， and the positive rate of Bcl-2 was positively correlated with Hp infection （r = 0.393， P < 0.05）. Conclusion The expression of FHIT protein in gastric carcinoma tissues is weakened， and the expression of Bcl-2 protein is enhanced， which are closely related to Hp infection， and the three interactions lead to the occurrence of gastric carcinoma.

[Key words] Gastric carcinoma; Helicobacter pylori; Fragile histidine triad; Bcl-2

胃癌是最常見的恶性肿瘤之一，在我国胃癌居各类恶性肿瘤发病率的首位，每年有15～20万人死于胃癌，占全部恶性肿瘤死亡人数的25%[1]。研究显示胃癌早期的5年生存率和10年生存率均达到90%，但大多数患者发现胃癌时已是中、晚期，此时治疗的预后不佳[2]。目前手术治疗是治疗胃癌最好的手段，其他治疗方式包括化学治疗、内镜下治疗和中医治疗等[3]，但结果不甚理想。胃癌的病因尚无定论，学者广泛认为是遗传、饮食、环境、幽门螺杆菌（Hp）感染等多因素相互作用引起的。脆性组氨酸三联体（fragile histidine triad，FHIT）基因是Ohta等[4]发现的一个抑癌基因，在正常组织中广泛表达，在多种食管癌、胃癌、膀胱癌等恶性肿瘤中表达减少，丧失抑癌作用。Bcl-2是从滤泡性B淋巴细胞中分离得到的一种致癌基因，是研究最早、最深入的凋亡抑制基因，通过线粒体介导的凋亡途径来参与肿瘤的发生[5]。目前关于Hp与FHIT和Bcl-2表达关系的研究较少，本研究对胃癌组织中FHIT、Bcl-2的表达进行检测，并分析其与Hp感染的关系，以期为胃癌的诊断和治疗提供一定参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

80例胃癌组织取自解放军第四六四医院于2013年1月～2017年1月期间行胃癌根治术的存档蜡块，其中男47例，女33例，年龄40～76岁，平均（58.3±6.5）岁。纳入标准：①所有组织标本均经过病理学诊断确诊为胃癌，且术前未进行放疗、化疗等特殊治疗;②既往无胃部手术史;③1个月内无抗炎药物、抗菌药物、H2受体拮抗剂、质子泵抑制剂等药物史。排除标准：①病历资料不完全;②住院期间未接受Hp检测者;③既往接受过Hp根除治疗。另选其中43例癌旁组织（距离肿瘤边缘>2 cm），均取自上述胃癌根治术病例。本研究经过医院医学伦理委员会审查。

1.2 实验方法

1.2.1 Hp检测  采用快速尿素酶试纸检测取胃黏膜组织，1～3 min内试纸由黄色变为樱红色为阳性，不变色者为阴性;采用Warthin-Starry染色对组织标本进行染色，阳性标本可见红黑色或黑色弧形、S形或海鸥状Hp，分布于胃黏膜表面黏液层、胃小凹及胃癌旁黏膜腺窝内。上述两项检测均呈阳性者判断为Hp感染阳性，两项均阴性者为无Hp感染，仅有一项阳性者不纳入实验。

1.2.2 FHIT和Bcl-2表达的检测  采用免疫组化染色的方法检测组织标本中FHIT和Bcl-2表达，FHIT兔-多克隆抗体和Bcl-2兔-多克隆抗体均购自北京博奥森生物科技有限公司。先将固定后的组织标本在60℃恒温烤箱中烤干1 h，室温冷却后进行脱水处理，用3%过氧化氢（H2O2）灭活内源性酶，再用乙二胺四乙酸（EDTA）抗原修复液修复抗原，PBS冲洗后滴加BSA封闭液，孵育10 min添加一抗，4℃冰箱孵育18 h，添加二抗，室温孵育20 min，PBS冲洗2～3次，加二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）溶液显色10 min，苏木精复染30 s，梯度酒精脱水，中性树胶封片，室温晾干，镜下观察。

1.2.3 染色结果判定  FHIT和Bcl-2蛋白阳性表达定位均位于细胞质，选已知阳性的组织切片为阳性对照，用PBS替代一抗作阴性对照。结果采用双盲半定量积分法，每张切片的染色结果由2名病理医师分别确认：①按细胞着色深浅程度评分：无着色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，黄褐色为3分;②按阳性细胞所占比例评分，每张切片随机计数10个视野中的阳性细胞百分比，选择高倍镜（400×）视野，避开边缘组织。百分比<5%为0分，5%≤百分比<25%为1分，25%≤百分比<50%为2分，百分比≥50%为3分;③将上述2项得分相加得到综合评分，综合得分≥4分判定为阳性（+），综合得分<4分判定为阴性（-）。

1.3 统计学方法

所有数据均采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman相关分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FHIT和Bcl-2在癌组织与癌旁组织中的表达

癌旁组织、胃癌组织FHIT蛋白的阳性表达率依次为62.79%、42.50%，胃癌组织阳性表达率低于癌旁组织（P < 0.05）。见图1（封四）、表1;癌旁组织、胃癌组织Bcl-2蛋白的阳性表达率依次为39.53%、63.75%，其中胃癌组织阳性表达率高于癌旁组织（P < 0.05）。见图2（封四）、表1。

2.2 FHIT和Bcl-2的表达与临床参数的关系

胃癌组织中FHIT的表达与淋巴转移、远处转移、分化程度、浸润程度和Hp感染均有关（均P < 0.05），与年龄、性别、肿瘤直径无关（均P > 0.05）;Bcl-2的表达与肿瘤直径、分化程度、浸润程度和HP感染有关（均P < 0.05），与年龄、性别、淋巴转移、远处转移等临床特征无关（均P > 0.05）。见表2。

2.3 相关性分析

FHIT的阳性率与Hp感染呈负相关（r = -0.295，P < 0.05）;Bcl-2的阳性率与Hp感染呈正相关（r = 0.393，P < 0.05）。

3 讨论

胃癌的明确病因尚不清楚，但自从Hp被发现以来，大量研究报道均显示其参与了胃癌发生过程[6-8]，鉴于这些研究结果国际癌症研究中心（IARC）在1994年将Hp定义为Ⅰ类致癌原[9-10]。Watanabe等[11]将Hp接种至5周龄的蒙古沙鼠，成功观察到了炎症细胞浸润、萎缩性胃炎、肠上皮化生和不典型增生的过程，并成功诱导胃癌，证实Hp在胃癌的发生中的作用。Hp感染与癌基因激活、抑癌基因沉默三者相互作用引起胃黏膜上皮细胞异常增生是胃癌发生的重要原因。

FHIT是一种新发现的抑癌基因，全长1095 bp，编码FHIT蛋白，是一种典型的Ap3A水解酶，Ap3A是ATP類似物，具有抑制蛋白激酶活性的作用，当FHIT蛋白活性降低时，Ap3A水平升高引起生长信号传导途径增强，阻断凋亡通道，导致肿瘤的发生[12-13]。FHIT蛋白还作用于mRNA帽类似物，可能通过影响关键基因mRNA的翻译发挥抑癌作用[14]。虽然目前尚不清楚FHIT究竟通过何种途径发挥抑癌作用，但是大量研究均表明其在胃癌的发生过程中发挥了重要作用，Baffa等[15]发现67%的原发性胃腺癌患者FHIT基因缺失或表达减少，Huiping等[16]利用RT-PCR技术对39例胃癌组织中FHITmRNA的表达进行分析，发现87.18%的标本存在FHIT低表达。本研究对组织标本进行免疫组化染色结果显示，癌旁组织、胃癌组织FHIT蛋白的阳性表达率分别为62.79%、42.50%，且胃癌组织阳性表达率低于癌旁组织（P < 0.05），提示FHIT蛋白表达降低或缺失与胃癌的发生存在密切关系。FHIT与患者临床特征的分析结果显示，在有淋巴结转移、有远处转移、分化程度低、浸润程度高和Hp感染的胃癌组织中，FHIT的表达显著减少，提示FHIT蛋白在胃癌的发生、发展、转移过程中均发挥重要作用，与Rocco等[17]研究结果一致。

Bcl-2是滤泡性B淋巴细胞中分离得到的一种癌基因，正常位于18号染色体上，在淋巴瘤中易位到14号染色体上[18]。Bcl-2基因被称作存活基因，其编码的蛋白质定位于线粒体内膜、核周膜和内质网上，通过抑制Casepase酶系和阻碍细胞色素C的释放[19]，阻碍凋亡途径，增强细胞对凋亡刺激因子的耐受力[20]。在体内Bcl-2与Bax基因的比例决定了细胞凋亡程度，当Bcl-2表达增加时，与Bax形成二聚体，凋亡被抑制，当Bax表达增加时，可拮抗Bcl-2的作用使细胞凋亡[21]。本研究结果显示，癌旁组织、胃癌组织Bcl-2蛋白的阳性表达率依次为39.53%、63.75%，胃癌组织阳性表达率高于癌旁组织（P < 0.05），与刘海峰等[22]的研究结果一致。Bcl-2与临床特征的比较结果显示，分化程度低、浸润程度高、肿瘤直径大和Hp感染组织中表达显著增高，Jr等[23]也发现Hp（+）胃癌组织中Bcl-2表达水平更高。本研究结果还显示，FHIT的阳性率与Hp感染呈负相关（r = -0.295，P < 0.05），Bcl-2的阳性率与Hp感染呈正相关（r = 0.393，P < 0.05），提示胃癌发生过程中，FHIT表达降低，Bcl-2表达增强，引起细胞异常增生，抵抗凋亡作用，导致肿瘤形成，而Hp感染可能作为一个重要因素引发了这一过程，其作用机制有待进一步研究确认。

综上所述，胃癌组织中FHIT蛋白表达减弱，Bcl-2蛋白表达增强，且均与Hp感染关系密切，三者相互作用导致了胃癌的发生。

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（收稿日期：2018-06-01  本文编辑：封   华）