草菇VEGF信号通路中vv—SPK基因的结构与表达分析

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摘要：VEGF通路是一条调控细胞增殖、分化、迁移、应激反应以及生存的信号通路。本研究从草菇基因组中获得1个在VEGF通路中编码SPK蛋白的基因，将其命名为vv-SPK，并对该基因进行结构分析，结果显示：基因vv-SPK全长1996 bp，包含11个内含子；ORF长为1 401 bp，编码466个氨基酸。通过BLASTP比对显示，vv-SPK基因与纹缘盔孢伞、双色蜡蘑以及紫蜡蘑的相似度最高；经过荧光定量PCR验证后发现，SPK蛋白的基因表达量与菌柄的伸长有关。根据SPK在VEGF通路中参与的细胞增殖途径以及SPK蛋白本身的激酶特性，推测其对草菇菌柄生长过程的细胞分裂和伸长有显著的促进作用，且草菇中可能存在SPK激酶介导的促进细胞增殖、伸长的信号通路。

关键词：VEGF通路；草菇；菌柄伸长；促进增殖

中图分类号：Q 786 文献标识码：A 文章编号：1008-0384（2017）03-263-05

草菇Volvariella volvacea（Bull.）singer是一种草生型食用真菌，在我国南方广泛栽培，其营养丰富、味道鲜美，深受市民欢迎。但由于它在伸长期菌柄快速生长，顶破外菌膜而出现开伞，开伞之后的菇体商品价值丧失，因此控制草菇开伞成为提高草菇商品价值的关键。目前，关于对草菇菌柄伸长影响因素的报道主要集中于相关酶、内源激素和转录因子方面。

血管内皮生长因子（vascular endothelialgrowth factor，VEGF）是一类广泛存在于真核生物的糖蛋白，对细胞的增殖、分裂、生存、转移及凋亡有特异性调控功能。VEGF所介导的信号通路是由VEGF超家族、VEGF受体、蛋白激酶C（PKC），鞘氨醇激酶（sphingosine kinase，SPK），Ras，Raf及胞外信号调节激酶1/2（extrace’llular signal-regulated kinase，ERK1/2）组成的级联作用通路。在分析草菇基因组和表达谱数据时发现有较多的基因注释到VEGF通路中，并且在菌柄伸长时期高表达。为此本研究选取该通路中鞘氨醇激酶的vv-SPK编码基因为代表进行研究，以期分析菌柄伸长的分子调控机制。

1材料与方法

1.1试验材料

从福建主栽草菇菌株H1521的4个菌柄生长的主要时期（纽扣期、蛋形期、伸长期、成熟期）的菌柄中收取样品。H1521菌株是由2个单孢菌株PYd21和PYd15配对获得的异核菌株，PYd21和PYd15从福建主栽种‘屏优一号’分离获得，且均已完成了基因组的测序。PYd21、PYd15和H1521均保藏在福建省食用菌种质资源保藏与管理中心。本实验所进行的基因组测序、转录组测序和表达谱测序均委托深圳华大基因研究院完成。

1.2vv-SPK基因的鉴定及分析

将基因组测序结果数据中预测分类为信号转导的基因从全基因组序列中截出，将序列提交至KEGG网站，在经过相似性对比后，记录系统预测VEGF代谢通路中的基因。通过预测从scaffold上获得的向前后各延伸2 000 bp长度的基因序列，使用其作为初始参考序列，在软件zoom lite（1.5.4）上进行reads定位分析，错配为40 bp，采用双末端模式比对。对结果进行分析，获得基因的转录起始及终止位置，确定基因序列上内含子及外显子位置。此后采用ORF阅读框对截获的CDS序列进行预测，则可获得其编码的完整蛋白序列。

使用生物软件ExPAsyProtparam在线分析蛋白的基本理化性质（http：//web.expasy.org/protparam/）；通过SignalP 3.0 Server网站对蛋白信号肽结构进行预测（http：//WWW.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）；通过在线预测网站TMHMM Server v.2.0预测蛋白跨膜结构（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）；使用网站PsORT II Prediction预测蛋白的亚细胞定位（http：//psort.hgc.jp/form2.html）；通过在线NetPhos3.0程序预测蛋白磷酸化位点（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhOS-3.1/）。

1.3序列比对及系统进化树分析

將验证后vv-SPK基因序列提交到EBI（European Bioinformatics Institute）上，使用在线程序InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）（Mulder and Apweiler，2007）预测分析其保守结构域；将ORF阅读框确定的蛋白序列，提交至生物网站进行比对，在NCBI、Fungipath等网站上下载多条相关蛋白的同源序列，先在ClustalX软件中作同源比对，参照其分析结果，再使用MEGA5.0软件最终构建这一基因的系统发育进化树，Bootstrap value设为1 000。

1.4基因表达量分析

用美国Omega Bio-Tek公司生产的E.Z.N.A.TM Plant RNA Kit试剂盒，按说明书操作过程，分别提取草菇不同时期菌柄样品总RNA，以不同样品的总RNA为模板，采用PrimeSc ript RTreagent Kit With gDNA Eraser（Perfect RealTime、TakaRa）试剂盒反转录获得第一链cDNA。

通过Z00M软件分析基因的结构，确定外显子和内含子位置，以最终确定的基因序列为模板，使用P rimer Premier 5.0软件设计荧光定量PCR引物（表1）。此外，本试验设定的内参基因GAPDH基因，引物序列见表1。RT-q PCR反应体系如下：SYBR^RPremix Ex TaqTMⅡ（2×）12.5μL、上下游引物（0.4 μmol·L^-1）各1μL、模板（cDNA）2μL、ddH₂O 8.5μL，总体积25μL。反应程序：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃复性30 s，40个循环。

2结果与分析

2.1vv-SPK基因的鉴定及分析

菇基因组拼接组装后进行KEGG注释，在VEGF信号通路中有1个编码鞘氨醇激酶的基因，命名为vv-SPK，该基因序列经过验证后已提交到GenBank，登录号为：KX279308。

应用ZOOM软件对vv-SPK进行结构分析，结果显示，该基因全长1996bp，序列包括内含子11个，分别为74、50、52、52、51、49、53、53、55、51、55 bp。通过NCBI网站的ORF阅读框对cDNA序列进行蛋白翻译，vv-SPK的ORF长度为1 401 bp，编码的氨基酸数量为466个（图1）。

将氨基酸序列提交NCBI进行比对，结果显示：草菇vv-SPK基因与一些担子菌vv-SPK基因有较高的相似度。其中，和纹缘盔孢伞Galerinamarginata（fr_）knhner、双色蜡蘑Laccariabicolor（Maire）P.D.Orton、紫蜡蘑Laccariaamethystina（Bull.ex Gray）Murr.的相似度最高，覆盖率分别为87%、85%、83%；E值均为0，一致性分别为54%、51%、51%。

将vv-SPK编码的蛋白序列提交至ExPASyProtparam，分析预测蛋白的一级结构及空间分子排布，结果如表2，其中SPK蛋白的相对分子质量为60 461.2 Da，接近鞘氨醇激酶2的相对分子质量6.56×10⁴Da，为亲水性蛋白，等电点在8～9，是碱性蛋白；在氨基酸组成中，带正电的氨基酸（Arg+Lys）略多于带负电荷的氨基酸（Asp+Glu）。从结构上看，SPK蛋白为稳定蛋白。

经预测，草菇中SPK蛋白无信号肽和跨膜结构域，说明其为非分泌蛋白，且亚细胞定位结果显示，SPK蛋白有47.8%位于细胞质中，17.4%位于细胞核，高尔基体和质膜以及线粒体上各含8.7%，剩余部分在囊泡分泌系统和细胞骨架上各含4.3%，定位结果与鞘氨醇激酶主要分布于细胞质中的特性一致。信号转导通路中的信息传递多是通过蛋白的逐级磷酸化或去磷酸化而实现，因而作为重要的功能位点，磷酸化位点的数量决定了蛋白的磷酸化类型。对SPK的磷酸化位点分析，SPK蛋白为丝/苏氨酸磷酸酶，磷酸化位点比较少，其上有35个Ser位点，18个Thr位点，最少的Tyr位点为7个。

将草菇中SPK蛋白序列提交至InterProScan网站分析蛋白结构，由结果可知，草菇的SPK蛋白含有两个已知结构域：二酯酰甘油激酶催化亚基Diacylglycerol kinase catalytic domain（IPR001206）和ATP-VAD类激酶结构域ATP-NAD kinase-like domain（IPR016064）（图2），两结构域均为激酶结构域，具有活化下游受体功能。

2.2 vv-SPK编码蛋白系统发育进化树的构建

下载担子菌及子囊菌中的SPK蛋白序列，使用MEGA软件构建草菇中vv-SPK基因编码蛋白的系统发育进化树。由图3可以看出vv-SPK基因编码的蛋白与双色蜡蘑L.bicolo、纹缘盔孢伞G.marginata及平菇Pleurotus ostreatus sensuStevenson等担子菌纲真菌聚为一类，子囊菌聚在另一类，这一结果进一步支持V"U-SPK是鞘氨醇激酶（SPK）编码基因的推定。

2.3vv-SPK基因在草菇菌柄伸长过程中的差异表达分析

收集草菇4个不同生长时期（纽扣期、蛋形期、伸长期、成熟期）的菌柄样品，分別提取RNA、反转录cDNA进行基因表达量分析，结果如图4所示。由荧光定量实验结果可知，vv-SPK基因的表达量从纽扣期开始增加，在伸长期达到最高，而在成熟期的表达量最低。根据Xie等的研究结果，草菇不同生长发育时期菌丝细胞长度差异显著，纽扣期、蛋形期和伸长期菌丝细胞长度分别为21.0、25.4、159.5gm。由此可见，vv-SPK基因的表达量与菌柄菌丝细胞伸长有显著的相关性。这一结果表明SPK蛋白可能参与细胞伸长的调控过程。

3讨论

草菇没有血管，但它的基因组注释到多个与人和动物血管内皮生长因子介导的VEGF信号通路中，这些基因在草菇不同生长发育阶段的表达量有显著差异，说明它们在草菇生长发育过程中有作用，这种作用有别于人和动物，这是一个新的功能。SPK是VEGF信号通路中的一个蛋白，Leclercq等发现真核细胞延长因子（eukaryoticelongation factor 1A，eEFlA）可与SPK相互作用，并直接激活SPK，从而促进细胞的纵向伸长。本研究基于对草菇信号转导蛋白的KEGG注释结果，发现有较多蛋白注释到这一通路上，我们推测草菇存在VEGF信号传导通路。本研究的结果也表明，该信号通路中的vv-SPK基因表达水平与草菇菌柄细胞伸长密切相关。草菇菌丝生长速度比其他食用菌快，在伸长期菌柄伸长速度也很快，这些特性可能与VEGF信号通路有关，这将为今后研究草菇生长特性和开伞控制研究提供一定的理论参考。

（责任编辑：张梅）