人端粒酶TERT蛋白和P16蛋白在宫颈病变中的表达研究

2022-04-08 08:26:22 | 浏览次数：

��zoޛ�)j馔�E3�� 总结hTERT、P16在宫颈病变中的表达特点及临床检测价值。结果对照组、CIN I、II、III级、Ca患者hTERT蛋白阳性率分别为5.00%、15.00%、60.53%、72.73%、96.55%，P16表达阳性率分别为10.00%、15.00%、73.68%、78.79%、100.00%。Ca、CIN II、III级患者hTERT蛋白、P16阳性率明显高于CIN I级患者与对照组，差异有统计学意义（P<0.05），并且Ca患者hTERT蛋白、P16阳性率明显高于其他组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论宫颈癌、CINIII、CINII组织中P16、端粒酶TERT蛋白表达阳性率均异常升高，表明其与宫颈癌的发生发展具有密切联系，可作为CIN分级与宫颈癌诊断、治疗评估的重要指标。

[关键词] 人TERT蛋白;P16蛋白;免疫组化检测;宫颈上皮内瘤变;宫颈癌

[中图分类号] R737 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2019）05（a）-0037-03

[Abstract] Objective To investigate the value of human telomerase TERT protein and P16 protein immunohistochemical detection in the diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia （CIN）. Methods A total of 91 CIN patients and 29 cases of cervical carcinoma diagnosed by pathology in our hospital from February 2016 to February 2018 were selected as the research objects， and 20 healthy women in the same period were selected as the control group. There were 91 CIN patients who were pathologically confirmed as CIN I in 20 cases， CIN II in 38 cases and CIN III in 33 cases. All patients examined the TCT and HPV. Specimens were collected to detect the expression of hTERT and P16. And the expression characteristics and clinical detection value of hTERT and P16 in cervical lesions were summarized. Results The positive rates of hTERT protein in control group of CIN I， II， III and Ca patients were 5.00%， 15.00%， 60.53%， 72.73%， 96.55%， and the positive rates of P16 expression were 10.00%， 15.00%， 73.68%， 78.79% and 100.00%， respectively. The positive rates of hTERT protein and P16 in Ca， CIN II and III patients were significantly higher than those in CIN I and control group （P<0.05）， and the positive rates of hTERT protein and P16 in Ca patients were significantly higher than those in other groups （P<0.05）， with statistically significant differences. Conclusion The positive expression rates of P16 and telomerase TERT protein in cervical cancer， CINIII and CINII tissues were all significantly increased， indicating that they are closely related to the occurrence and development of cervical cancer and can be used as an important indicator for CIN classification， diagnosis and treatment evaluation of cervical cancer.

[Key words] Human TERT protein; P16 protein; Immunohistochemical detection; Cervical intraepithelial neoplasia; Cervical cancer

宫颈上皮内瘤变（CIN）是一种正常宫颈组织向宫颈癌发展的特殊过程，通常分为CINI、CINII、CINIII，若不进行及时检查、诊断及治疗，可能逐渐进展，最终可能发展成为宫颈浸润癌，严重影响患者生存期及生活质量[1]。相关临床研究表明，CIN是基于针对性治疗可有效推延、阻遏、逆转宫颈病变但由于CIN缺乏典型的临床症状，患者出现症状就诊时可能已进展为原位癌，甚至浸润癌，此期即使接受治疗往往预后也较差，因此研究CIN早期筛查及诊断方法具有重要的临床意义[2-3]。该组研究通过对2016年2月—2018年2月于该院就诊的91例CIN患者、29例宫颈癌及20例健康女性进行对照研究，探讨人端粒酶TERT蛋白与P16蛋白免疫组化检测在宫颈上皮内瘤变（CIN）诊断中的应用价值。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 基础资料

方便选取该院就诊并经病理确诊的91例CIN患者及29例宫颈癌（Ca）作为研究对象，另选取同期健康女性20名作为对照组。91例CIN患者经病理证实为CIN I级20例，CIN II级38例，CIN III級33例，患者年龄35～51岁，平均年龄（42.7±4.0）岁，宫颈癌患者年龄38～55岁，平均年龄（45.2±4.7）岁，对照组为同期子宫肌瘤手术患者，年龄31～59岁，平均年龄（40.2±5.9）岁。

纳入标准：所有患者对该组研究内容完全知情同意书;已通过该院伦理道德委员会审核;经组织病理学检查明确诊断为CIN及宫颈癌;所有患者行TCT、HPV筛查;对照组因其他非宫颈病变切除全子宫，且术后病理证实无宫颈病变;无放疗、化疗治疗史。

排除标准：合并其他部位恶性肿瘤;HPV感染患者;无病理学诊断资料;接受放疗、化疗治疗。

1.2 研究方法

1.2.1 试剂与仪器鼠抗人P16INK4A蛋白单克隆抗体（福州迈新生物公司）;免疫组化SP法试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）;人端粒酶逆转录酶抗体（北京博奥森生物技术有限公司）;ELX-800酶标仪（美国Biotek公司）

1.2.2 检测方法采用免疫组化SP法检测病变组织hTERT、P16蛋白表达情况，完全按照试剂盒说明书进行操作，①制片：将包有子宫颈组织的蜡块放在切片机上，对组织块进行4～6 μm厚度切片，并置于45℃蒸馏水中展片，自然晾干后，将所需玻片放入60℃烤片机内30 min以上;②脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯I-二甲苯II-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精;③阻断：玻片中添加SP试剂盒中试剂A，孵育10 min，以灭活内源性过氧化物酶活性;PBS冲洗2～3次，5 min/次;④抗原修复：置于0.01枸橼酸缓冲液中煮沸5 min后自然冷却20 min以上，再用冷水冲洗罐子，加快冷却至室温，PBS冲洗2～3次，每次5 min;⑤封闭：滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20 min，甩去多余液体，不必冲洗;⑥滴加I抗50 μL，4度冰箱过夜;隔日从冰箱取出，室温静置1 h，PBS冲洗2～3次，5 min/次;⑦滴加辣根过氧化物酶标记物的II抗50 μL，室温静置10 min，PBS冲洗2～3次，5 min/次;⑧滴加链霉素亲和素-过氧化物酶，室温孵育10 min，PBS冲洗2～3次，5 min/次;⑨显色：DAB显色10 min，在显微镜下掌握染色程度;自来水冲洗10 min终止反应;⑩复染：苏木精复染2 min，盐酸酒精分化，自来水冲洗10～15 min;常规脱水，透明，封片，镜检。

1.3 观察指标

P16INK4A蛋白表达情况，当胞质、细胞核内出现黄色颗粒则为染色阳性细胞并采用半定量法评价P16INK4A蛋白表达强度，其中阴性为阳性细胞比例低于10%，弱阳性（+）为阳性细胞比例10～30%且颜色呈棕黄色，阳性（+ +）则为阳性细胞比例31～70%，颜色为棕黄色，强阳性（+ + +）阳性细胞比例超过70%且颜色呈棕褐色。

hTERT蛋白主要定位于细胞核和/或细胞质，镜下以出现棕黄色细颗粒为阳性。采用半定量积分法判定结果，先按染色强度计分：0分，无色;1分，浅黄色;2分，棕黄色;3分，棕褐色。再按阳性细胞所占百分比计分：0分，阴性;1分，阳性细胞<25%;2分，25%～<50%;3分，50%～<75%;4分，≥75%。两项得分相乘后判定免疫组化结果，分为阳性和阴性两组，0～4分为（-）组，≥4分为（+）组。

1.4 统计方法

采用SPSS 19统计学软件进行分析数据。计量资料采用t检验，应用（x±s）表示，计数资料[n（%）]采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组hTERT蛋白表达情况比较

Ca、CIN II、III级患者病变组织hTERT蛋白阳性率明显高于CIN I级与对照组，差异有统计学意义（P<0.05），Ca患者hTERT蛋白阳性率明显高于CIN II、III级患者，差异有统计学意义（P<0.05），虽然CIN I级患者hTERT蛋白阳性率略高于对照组，但统计学分析差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 各组P16蛋白表达情况比较

Ca、CIN II、III级患者病变组织P16蛋白阳性率明显高于CIN I级与对照组，差异有统计学意义（P<0.05），Ca患者P16蛋白阳性率明显高于CIN II、III级患者，差异有统计学意义（P<0.05），虽然CIN I级患者P16蛋白阳性率略高于对照组，但统计学分析差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

3 讨论

hTERT蛋白分子主要分布于细胞核中，其作为端粒酶催化亚基可用于维持端粒长度，同时在维持端粒结构完整性方面同样具有重要的作用，既往研究表明[4]，hTERT蛋白能够直接参与肿瘤细胞生长与增殖，而近年来有报道通过RNA干扰技术抑制肿瘤细胞内hTERT表达，结果发现端粒酶活性受到明显抑制，并且肿瘤细胞对电离辐射、化疗药物的敏感性发生不同程度的增加，间接证明hTERT蛋白分子的表达与肿瘤的发生发展具有密切联系[5-6]。而该组研究结果显示，对照组、CIN I、II、III级、Ca患者hTERT蛋白阳性率分别为5.00%、15.00%、60.53%、72.73%、96.55%，P16表达阳性率分别为10.00%、15.00%、73.68%、78.79%、100.00%。Ca、CIN II、III级患者病变组织hTERT蛋白阳性率明显高于CIN I级与对照组，Ca患者hTERT蛋白阳性率明显高于CIN II、III级患者，虽然CIN I级患者hTERT蛋白阳性率略高于对照组，但统计学分析无显著差异，结果提示随着CIN等级的提升，hTERT蛋白阳性率呈上升趋势，表明hTERT蛋白阳性水平与宫颈上皮内瘤变、宫颈癌的发生具有密切联系[7]。

而P16INK4A蛋白作为一种肿瘤抑制基因，对肿瘤周期具有一定的调控能力，能够与细胞周期蛋白CDK4、CDK6相互作用并阻断其与细胞周期蛋白D1的结合，从而阻止Rb磷酸化、导致细胞周期停滞于G1期，局部细胞无限增殖而形成肿瘤[8]。近年来肿瘤病理生理学研究表明[9]，组织细胞癌变的发生与发展是多基因共同作用的结局，而P16INK4A基因作为肿瘤周期调控因子，其确实直接可导致细胞由G1期进入S期，从而导致细胞在未成熟的状态下分离形成永生化，因此國内外已将P16INK4A基因作为宫颈病变的重要生物学行为及预后预测指标[10]，而该组研究结果显示Ca、CIN II、III级患者病变组织P16蛋白阳性率明显高于CIN I级与对照组，Ca患者P16蛋白阳性率明显高于CIN II、III级患者，虽然CIN I级患者P16蛋白阳性率略高于对照组，但统计学分析无显著差异，结果提示随着宫颈病变的发展，患者P16INK4A蛋白的表达水平随之升高，其对宫颈病变的诊断与病情评估具有重要意义。

综上所述，宫颈癌组织中P16、端粒酶TERT蛋白表达阳性率异常升高，其与宫颈癌的发生发展具有密切联系，可作为CIN分级与宫颈癌诊断、治疗评估的重要指标。

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