分月扇舟蛾颗粒体病毒蛋白基因的序列测定和分析

材料与方法

1.1试验材料

病毒的分离：从杨树林间采集病死幼虫，保存在4 ℃冰箱中。虫尸经过研钵研磨、三层纱布过滤，采用差速离心法纯化病毒。滤液先以800 r/s 低速离心20 min，离心3次，去掉沉淀，再以12 000 r/s高速对上清液离心30 min，离心3次，最后得到的白色沉淀即为纯化的GV[3]。

1.2试验方法

1.2.1蛋白基因的纯化和DNA的提取。

取纯化的病毒悬液，加400 μl碱解液（0.1 mol/L Na2CO3，0.15 mol/L NaCl，0.001 mol/L EDTA，pH 10.5），碱解2 h，加入SDS静置30 min，溶液变清，12 000 r/min离心5 min，取上清液，用500 μl酚、酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）各抽提1次，上清液用2倍体积无水乙醇沉淀，75%乙醇洗涤，最后得到的DNA沉淀溶于30 μl水中，保存于4 ℃冰箱中。

1.2.2蛋白基因的引物设计。

参照杨扇舟蛾颗粒体病毒（CacGV）、苹果蠹蛾颗粒体病毒（CpGV）、苜蓿绿叶蛾颗粒体病毒（PsGV）、云杉芽卷叶蛾颗粒体病毒（CmGV）、茶小卷叶蛾颗粒体病毒（AoGV）、美国白蛾颗粒体病毒（HcA5-1GV）蛋白基因设计兼并引物。

引物序列为上游：5′-CBGGHAARAAYGWDMGVATCAC-3′，

下游：5′-AACARDAGVGAYACYTCRATC-3′。

引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3DNA序列测定及序列分析。

序列测定由上海生工生物工程有限公司完成，核苷酸序列以及氨基酸序列的相似性分析软件为ClustalX（W），分析所用的各种颗粒体病毒数据均来自GenBank数据库。密码子偏向性分析运用欧洲分子生物学开放软件包（EMBOSS），运行chips和cusp程序对其进行计算及分析[4]；疏水性分析利用Bioedit软件采用Kyte和Doolittle算法[5]，联网至http：//genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/对该蛋白序列进行跨膜区分析，二级结构预测采用SOPMA法[6-7]。

2结果与分析

2.1CaGV granulin基因的序列分析

CaGV granulin基因的核苷酸序列见图1。对测序所获得的序列进行核酸组成分析，测序得到498 bp的片断，GC含量47.9%，AT含量52.1%。

2.2CaGV granulin的相似性分析

应用Clustalxl.81软件比较新测定的CaGV granulin与较为典型的6种GV的granulin基因的相似区，结果见图2。这7种颗粒体蛋白基因核苷酸与氨基酸的相似性分析见表1。

核苷酸序列的相似性分析表明，CaGV granulin基因的核苷酸序列与CacGV（杨扇舟蛾颗粒体病毒）、PsGVA25-6（苜蓿绿夜蛾颗粒体病毒）、HcGVA5-1（美国白蛾颗粒体病毒）、CpGVA11-2（苹果蠹蛾颗粒体病毒）、CmGVA11-1（云杉芽卷

图1CaGV granulin基因核酸序列及推导的氨基酸序列

注： “*”表示7种颗粒体病毒完全保守的氨基酸残基；“：”表示性质相似的氨基酸残基；“.”表示弱作用残基；“-”表示插入或缺失的氨基酸残基。

图27种颗粒体病毒蛋白基因氨基酸序列的比较

表1颗粒体蛋白基因的核苷酸序列（上）及氨基酸序列（下）的相似性分析

%

项目CaCacPsA25-6HcA5-1CpA11-2CmA11-1AoS45

Ca-97.5981.8673.2981.3480.5781.33

Cac98.18-82.5273.3280.4281.3382.20

PsA25-692.7394.71-74.1383.2080.5681.53

HcA5-182.0082.3584.97-76.7274.1972.23

CpA11-295.0694.1294.5883.01-81.6081.93

CmA11-195.6896.3994.5883.0195.78-79.72

AoS4594.5596.4794.1281.7096.9995.18-

叶蛾颗粒体病毒）、AoGVS45（茶小卷叶蛾颗粒体病毒）granulin基因核苷酸序列的相似性分别为97.59%、81.86%、73.29%、81.34%、80.57%、81.33%，显示了很高的同源性；由核苷酸推导的氨基酸序列之间的比较结果也相似，CaGV granulin基因的氨基酸序列与CacGV、PsGVA25-6、HcGVA5-1、CpGVA11-2、CmGVA11-1、AoGVS45 的相似性分别为98.18%、92.73%、82%、95.06%、95.68%、94.55%。

2.3Granulin基因蛋白质的基本性质分析

2.3.1氨基酸的成分分析。

根据测定的核苷酸序列推测该基因编码166氨基酸，共有20种，由22个酸性氨基酸、18个碱性氨基酸、89个中性氨基酸组成，其中谷氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸含量最高，含量较少的是丙氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸（表2）。通过Compute pI/Mw对CaGV granulin基因编码的蛋白序列进行分析，等电点为5.42，分子量1.981 9×104 Da，颗粒体蛋白基本是电中性，这对于形成颗粒体保持电中性是有意义的。亲水性氨基酸70个占42.17%，疏水性氨基酸79个占47.58%，两者占整个氨基酸的89.75%，说明颗粒体蛋白基因中富含亲水性氨基酸和疏水性氨基酸。

表2CaGV蛋白基因的氨基酸组成

氨基酸数目Mol∥%氨基酸数目Mol∥%

Asp84.82Asn84.82

Glu148.43Ile137.83

Lys74.22Thr106.02

Arg116.63Leu137.83

Ser95.42Ala42.41

Phe127.23Met53.01

Val106.02Cys31.81

Gly63.61Pro106.02

Gln84.82Trp42.41

His31.81Tyr84.82

2.3.2蛋白质二级结构预测。

利用SOPMA程序对翻译的氨基酸序列进行二级结构分析，具体分布见图3。

注：h代表α螺旋，e代表β折叠，t表示β转角，c代表无规卷曲。

图3CaGV蛋白基因的二级结构

由图3可知，CaGV蛋白基因二级结构较复杂，分别由α螺旋（38.55%）、β折叠（18.07%）、β转角（10.24%）和无规卷曲（33.13%）组成，其中α螺旋为主要结构。

3结论

该研究通过PCR扩增得到了分月扇舟蛾颗粒体病毒granulin基因的部分序列，针对该序列分析其核苷酸组成，根据核酸序列推测了其氨基酸序列，在此基础上利用clustalxl.81软件对典型的7种颗粒体病毒的granulin基因进行了相似性分析。结果表明，分月扇舟蛾颗粒体蛋白基因与杨扇舟蛾的相似性最高，亲缘关系最近；并对该基因蛋白质基本性质进行研究，分析了该基因编码区的蛋白组成，其等电点为5.42，分子量1.981 9×104 Da；预测了蛋白质的二级结构，结果显示，该基因的二级结构主要由α螺旋（38.55%）、β折叠（18.07%）、β转角（10.24%）和无规卷曲（33.13%）组成，其中α螺旋为主要结构。

参考文献

[1] 车永贵，张家利，朱华年.分月扇舟蛾生物学特性及其综合防治[J].吉林林业科技，2001，30（5）：18-26.

[2] 张丽红，彭建新，洪华珠.颗粒体病毒的离体复制[J].微生物学杂志，2004，24（1）：60-62.

[3] 李海霞.分月扇舟蛾颗粒体病毒病理、毒力及蛋白基因的研究[D].北京：中国林业科学研究院，2006.

[4] 王艳，马文丽，郑文岭.SARS冠状病毒的密码子偏爱性分析[J].生命科学研究，2003，7（3）：219-224.

[5] 张成岗，贺福初.生物信息学方法与实践[M].北京：科学出版社，2002.

[6] 黄韧，薛成.生物信息学网络资源与应用[M].广州：中山大学出版社，2003.

[7] 张阳德.生物信息学[M].北京：科学出版社，2004.