基于移动窗F检验法的中药配方颗粒混合均匀度近红外分析研究
[摘要] 混合均匀度是保证中药配方颗粒产品批内质量一致性的关键。该文以乌梅配方颗粒中乌梅提取物粉末糊精体系（糊精比例10%）为研究对象，在其混合过程中设计多个取样位点，将采集的粉末样品进行近红外（near infrared，NIR）漫反射光谱分析，并结合移动窗F检验（moving window F test，MWF test）法对混合过程均匀度进行判断。同时采用HPLC对混合过程中枸橼酸的含量变化进行分析，以验证MWF test法的有效性。结果显示乌梅配方颗粒混合过程在200～300 r达到混匀状态，300～400 r出现脱混现象，400 r后又趋于稳定，移动窗F检验分析结果与HPLC分析结果基本一致。移动窗F检验算法通过F界值设定均匀度判别阈值，避免了常规移动窗标准偏差法中阈值设定的随机性和模糊性，可推广应用于其他中药粉末混合过程的在线监控。
[关键词] 中药配方颗粒； 混合均匀度； 近红外； 移动窗F检验法； 过程分析技术
混合过程是中药配方颗粒制备工艺的关键环节之一。受中药饮片质量波动的影响，单味中药饮片经提取、浓缩、干燥成粉末后，收率存在一定差异，须加入适量辅料调节总量，以确保临床应用剂量的一致性[1]。中药提取物粉末与辅料混合的均匀度，是保证配方颗粒批内质量一致性的关键。目前，中药配方颗粒的混合过程尚缺乏有效的混合均匀度决策工具，主要通过停机取样，采用离线检测手段对主要成分含量差异度进行分析，效率较低。
近红外（near infrared，NIR）光谱技术凭借其快速、无损、绿色等诸多优势在制药混合过程中应用广泛[24]。NIR光谱技术应用于药物粉末混合过程监控需结合化学计量学方法对过程数据进行解析，可分为定性和定量分析方法两类[5]。定量分析方法如偏最小二乘法[6]、偏最小二乘判别分析[7]等，其准确性依赖于所建立的定量模型，在日常使用中，需不断对模型进行更新和维护。定性方法包括移动块标准偏差法[8]，谱间差异法[9]，欧氏距离/马氏距离法[10]以及基于质量源于设计理念所建立的混合过程终点设计空间的判断方法[11]等。本研究创新性的采用NIR光谱技术结合移动窗F检验（moving window F test，MWF test）算法对中药配方颗粒混合过程进行分析监控，并以离线HPLC分析结果对该法的有效性进行了验证。
1 材料
Antaris傅里叶变换近红外光谱仪（美国Thermo Nicolet公司），Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司），HTD350型柱式料斗混合机（武汉恒达昌机械设备有限公司），81030A1100型粉末末端取样器（昆山莱曼设备有限公司）。
乌梅提取物粉末和辅料糊精均由北京康仁堂药业有限公司提供，枸橼酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号100396201302）；甲醇（色谱级，美国Fisher公司），乙醇（分析级，北京化工厂），纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。
2 方法
2.1 样品制备
将15.80 kg乌梅提取物粉末和1.54 kg糊精先后置于75 L柱式混合机料斗中，填料系数约为66%，混合机转速设置为14 r·min-1。停机取样方案：0 r停机取样；1～150 r，间隔5 r停机取样；151～250 r，间隔10 r停机取样；251～430 r，间隔15 r停机取样。模拟混合时间总计约30 min。每次停机均于6个预设取样位点取样，取样位点分布见图1。由于乌梅提取物、糊精的流动性较差，致使停机后粉末床呈现斜坡状态，其中，取样位点1代表粉末床上层，取样位点2和3代表罐体死角，取样位点4和5代表粉末床中层，取样位点6代表粉末床下层和罐体死角。对所取的318个粉末样品进行近红外漫反射光谱扫描。选择乌梅提取物粉末中的指标性成分枸橼酸含量的变化作为混合均匀性的评价指标。0，15，30，40，60，80，100，120，135，150，190，210，280，310，370，430 r时停机采集的96个粉末样品进行枸橼酸含量测定。粉末样品经液相分析，若6个取样位点之间枸橼酸含量的RSD小于5%，即认为已经混合均匀[12]。
2.2 NIR 光谱采集
采用Antaris傅里叶变换近红外光谱仪，以空气做背景，采用积分球漫反射模式以旋转样品杯法采集光谱，分辨率为8 cm-1，光谱扫描范围1万～4 000 cm-1，增益为2，每份样品扫描16次后取平均值。
2.3 HPLC分析
2.3.1 样品制备 取收集到的粉末样品0.1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL水溶解，称重，超声提取30 min，加水补足失重，静置滤过，即得。
2.3.2 色谱条件 采用ESC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温25 ℃，流速0.5 mL·min-1，检测波长210 nm，进样量10 μL，流动相甲醇0.5%磷酸二氢铵缓冲液（5∶95）。
2.4 移动窗F检验法原理
移动窗F检验法的原理是计算出2个连续窗口的方差（S2i-1，S2i），随即进行方差齐性检验（S2i/S2i-1），求得F值；根据F分布和窗口自由度，设定阈值Fcrit，当F值持续小于Fcrit时，即认为2个窗口方差差异不具有统计学意义，即达到混合均匀状态。原理示意图见图2。
在采用该算法监测混合过程时，需根据研究需要设置检验水平α，主成分数k和窗口大小w。检验水平α可设置为0.05或0.10，即在较低的概率水平下接受将混合均匀错判为未混合均匀。如将该方法引入到在线监控研究中，随着光谱采集频率增加，相邻光谱间的差异减小，可根据研究需求调节进行齐性检验的2个窗口间距离或者采用2个并行的窗口进行分析。移动窗F检验算法应用于中药混合过程具有诸多优势：①该方法属于批次内建立模型，在操作条件发生变化时，如填料系数、转速发生改变等，无需重新校准模型。②根据检验统计界值设置阈值，避免了常规移动窗标准偏差算法中阈值设定的随机性和模糊性[13]。
2.5 数据分析软件
近红外光谱采集采用Thermo Scientific RESULT软件，光谱预处理采用SIMCAP +11.5（Umetrics， Sweden）软件，主成分分析及其他计算在Matlab 2015a（Mathwork， USA）软件平台上完成。
3 结果与讨论
3.1 HPLC分析结果
配制6个不同浓度的标准溶液，进样分析，以色谱峰面积（Y）对样品浓度（X）进行线性回归，线性范围是81.64～1 024 mg·L-1，r=0.999 5。仪器精密度检查RSD为 1%，表明仪器精密度良好。重复性检查RSD为2%，表明该方法的重复性良好。稳定性考查结果表明样品溶液在12 h内稳定。平均加样回收率为101.4%，RSD为2.8%，表明该方法的准确度良好。
本研究以枸橼酸含量差异作为粉末混合均匀性的评价指标，经过HPLC分析，各取样位点枸橼酸含量的变化趋势见图3。由图3可知在开始的
200 r，各取样位点枸橼酸含量变化剧烈，随着混合过程的进行，各点含量逐渐趋于稳定。取样位点2和取样位点3均在300～400 r出现了波动。6个取样位点之间枸橼酸百分含量的相对标准偏差（RSD）值变化趋势见图4。由图4可知，乌梅提取物粉末糊精混合体系在60～140 r和200～300 r左右达到混匀状态（RSD< 5%），140～200 r和300～400 r出现脱混现象，400 r后又趋于稳定。
3.2 光谱预处理
乌梅提取物粉末糊精混合体系采集的NIR原始光谱图见图5A，由于受粒度分布不均匀及粉末颗粒大小不同产生的散射对光谱的影响，可导致近红外光谱基线漂移。本文在应用近红外光谱前采用标准正则变换（standard normal variate，SNV）[14]的预处理方法，以消除由于颗粒散射及光程差异给光谱带来的影响，经SNV预处理后的NIR光谱图见图5B。
3.3 移动窗F检验算法中参数的确定
使用移动窗F检验算法进行终点判断前，需根据研究需求确定检验水平α、主成分数k和窗口大小w。本研究α设置为0.10，即将混合均匀错判为未混合均匀的概率是10%。采用Matlab软件对原始光谱进行主成分分析。第一个主成分的累积贡献率为99.99%，即第一个主成分可表征原变量99.99%的信息，因此选择第一个主成分进行后续计算。窗口内光谱过少则代表性差，光谱过多易忽略一些光谱间的差异，致使终点判断的灵敏度降低[15]。本研究中窗口大小设置为6，即每次选取6条连续的光谱进行计算，并依次用新增光谱对所选光谱中时间最早的一条进行迭代替换。即本研究中Fcrit=F0.05，5，5=5.05。
3.4 移动窗F检验监测模型建立和应用
本文对混合过程中6个取样位点采集的粉末样本的NIR光谱，分别采用移动窗F检验法进行分析，各取样点的分析结果见图6。如图6所示，取样位点1，2，4，6，在40～100 r左右出现短暂的稳定，检验统计量F
4 结论
本实验采用近红外漫反射光谱法结合移动窗F检验算法，以乌梅提取物粉末糊精混合体系为研究对象，分析中药配方颗粒混合过程均匀度，判定结果与离线HPLC分析结果一致。基于本研究6个取样位点综合分析可知，若混合过程只采用一个监测位点，并不能充分代表混合罐内混合均匀度的变化情况。因此，在混合过程在线监控过程中，建议采用多位点同时监测的方法。如将本研究所建方法与在线多探针近红外光谱分析技术相结合，有望实现中药混合过程的深入理解和终点准确控制。
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[责任编辑 孔晶晶]
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