白花蛇舌草提取物对结肠癌HT-29细胞Bcl-2和Bax表达的影响

结直肠癌(CRC)是危害人类健康的主要肿瘤之一,在美国的各种肿瘤中位列第三[1]。最新统计数据显示2007年估计在15多万CRC的新病例中就有5万多人死于CRC[1,2]。虽然一直以来欧美发达国家是结肠癌的高发地区,但近些年来随着经济的发展,人们的生活方式特别是饮食结构的改变,我国结肠癌发病率也呈逐年上升趋势,严重威胁着国人的生命和健康[3]。近年来随着对结肠癌认识的加深,在治疗方面有了较大的发展,但是至今尚未发现有效的药物治疗手段。白花蛇舌草为茜草科耳草属植物白花蛇舌草[hedyotis diffusa Willd.[Oldenlandia diffusa (Willd.) Roxb.]的全草,始载于《广西植物志》,味苦、淡,性寒,无毒,归胃、大肠、小肠经。其主要功效是清热解毒、消痛散结、利尿除湿,广泛用于治疗各种炎症和肿瘤。但白花蛇舌草的抗肿瘤分子作用机制尚未完全阐明,并根据白花蛇舌草中医的归大肠经理论,故就白花蛇舌草对人结肠癌HT-29细胞凋亡关键调控蛋白Bcl-2/Bax表达的影响进行研究。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1药物的制备

白花蛇舌草购自福建中医药大学国医堂医院,批号:09072201。白花蛇舌草全草,用10倍85%乙醇回流提取2次,合并后过滤,回收乙醇,滤液浓缩至相对密度1.05,经喷雾干燥得粉末。得到得提取物用40%DMSO溶解,配制成0.4g/mL溶液,经高压灭菌后于4℃保存待用。

1.1.2细胞株

结肠癌细胞株(HT-29),中南大学湘雅中心实验室。

1.1.3试剂

RPMI1640培养基、胰蛋白酶(trypsin),胎牛血清(fetal bovine serum,FBS),Hyclone公司;四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)干粉,Sigma公司;RT试剂盒、Trizol、PCR试剂盒,Promega公司;Taq聚合酶、Rnase inhibitor,TaKaRa公司;引物由上海英俊生物有限公司合成。

1.1.4仪器

RE-2000旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;DLSB-5/20低温冷却循环泵,郑州长城科工贸有限公司;B-290型实验室小型喷雾干燥机,瑞士Buchi公司;ELX800酶标仪,BioTek公司;HF212UV二氧化碳培养箱,Heal Force;IX70荧光倒置相差显微镜,日本OLYMPUS;GST-1型PCR仪,英国GSTORM公司;Gel DOC 2000型凝胶成像分析系统、APC 300型电泳仪,美国Bio-Rad公司;DU-650型蛋白核酸分析仪,,美国Beckman公司;5417R高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养

将人结肠癌细胞株HT-29置于含10%热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养液中,于37℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。

1.2.2MTT法检测细胞活性

取对数生长期的人结肠癌细胞HT-29,用0.25%胰酶消化并收集细胞。以RPMI1640培养液(含10%FBS)制成细胞悬液,进行细胞计数,调整细胞密度为1×105个/mL,接种于96孔培养板中,每孔100uL,常规培养24h,使细胞同步化。细胞分为4组,白花蛇舌草给药浓度分别为0mg/mL、1mg/mL、3mg/mL、5mg/mL,以上各组均设8个复孔。继续培养24h,吸弃各孔中的液体,每孔加入0.5mg/mL的MTT溶液100uL,37℃孵育4h,然后吸弃各孔中的液体,加入DMSO 100uL/孔,振荡混匀,室温放置10min,使结晶充分溶解并混匀,于全自动酶标仪570nm测定各组吸光度值(即A值),并按下列公式计算增殖抑制率:抑制率(%)=(对照组A值一实验组A值)/对照组A值×100%。

1.2.3细胞形态学观察

HT-29细胞用白花蛇舌草提取物培养24h后,在倒置显微镜下观察细胞的形态变化并拍照。

1.2.4RT-PCR检测Bc1-2和Bax mRNA表达

对数生长期的HT-29细胞胰酶消化后,取2×105个细胞/孔,接种于6孔板,24h后进行药物干预,继续培养24h后,用Trizol法提取总RNA,逆转录为cDNA。取上述细胞提取总的RNA,总RNA的提取参照Trizol试剂(Invitrigen公司)说明书进行操作。取总RNA 1µg,应用逆转录(RT)试剂盒进行逆转录反应。PCR反应体系(20μl体系):cDNA 1μl,10×Taq Buffer 2ul,25mM MgCl2 1.2μl,10mM dNTP 0.4μl,1U/ul Taq酶0.8μl,上下游引物各1μl,加DEPC水至20μl,震荡混匀,高速离心10s后,置PCR热循环仪扩增;扩增条件为:95℃预变性4min,94℃变性30s,X℃退火40s,72℃延伸40s,持续35个循环,最后72℃延伸10min。按说明书进行操作。PCR 产物经在1.5%琼脂糖凝胶上电泳后进行光密度扫描,以GAPDH基因为内参,各基因的扩增条带的光密度值与各自内参的光密度值之比作为衡量参数,Quantity one 软件分析。具体的退火温度及引物序列见表 1。

表1PCR引物序列、退火温度及产物长度

NamePrimersTm(℃)Product(bp)

Bcl-2F: 5-CAG CTG CAC CTG ACG CCC TT-3

R: 5-GCC TCC GTT ATC CTG GAT CC-355362

BaxF: 5-TGC TTC AGG GTT TCA TCC AGG-3

R: 5-TGG CAA AGT AGA AAA GGG CGA-355253

GAPDHF: 5-GTC ATC CAT GAC AAC TTT GG-3

R:5-GAG CTT GAC AAA GTG GTC GT-358450

1.2.5Western Blot法检测Bcl-2和Bax的蛋白表达

HT-29细胞按2 × 105个细胞/孔接种到6孔板中,每孔用2ml培养液。培养24h后,分别用不同浓度的白花蛇舌草提取物处理,处理24h后的细胞用裂解液抽提。含有等量蛋白的细胞裂解液用样品缓冲液溶解后,将细胞的蛋白样品定量,变性;进行聚丙烯酰胺凝胶电泳;转膜;脱脂牛奶封闭2h;洗膜,加入Bcl-2和Bax (稀释倍数1:1000)的一抗以及β-actin(稀释倍数1:1000)作为阳性对照,在4℃震荡过夜,加入辣根过氧化物酶标记的二抗(稀释倍数1:25000)后,室温孵育1h,然后用含0.25 % tween-20的TBS洗膜,加入1:1的ECL发光液,在25℃温育5min,立即曝光,等条带清晰后将胶片取出,用凝胶成像系统扫描并进行数据分析。

1.2.6 统计分析

采用SPSS12.0软件进行分析,实验数据用±S表示,组间比较采用单因素方差分析;其中P﹤0.05为有差异,P﹤0.01为有显著性差异,均有统计学意义。

2结果

2.1 白花蛇舌草提取物对HT-29增殖的抑制作用

白花蛇舌草提取物浓度达到1mg/mL对结肠癌细胞HT-29增殖有明显的抑制作用(p<0.01),随着药物浓度的升高对HT-29的抑制率也升高,呈现剂量依赖。同时,各组间的比较也有显著性差异(p<0.01)。结果见表2。

表2白花蛇舌草提取物对HT-29增殖的影响(±s,n=8)

组别浓度(mg/ml)OD值抑制率(%)

对照组00.288±0.020

实验组10.233±0.0221)19.097

30.190±0.0211)34.028

50.118±0.0131)59.028

注:与对照组比较,1)p<0.01

2.2 白花蛇舌草提取物对HT-29细胞形态的影响

倒置显微镜下观察,空白组HT-29细胞胞质均匀,核仁清楚,伸展性好,生长良好,形成贴壁的梭形细胞。随着白花蛇舌草提取物作用浓度的增加,可观察到细胞形态逐渐改变,细胞数逐渐减少,细胞多呈圆形,体积缩小,折光性差,细胞悬浮、脱落而死亡。本实验结果显示白花蛇舌草提取物能够抑制HT-29细胞的增殖,并随浓度的增加而增强,呈明显的量效趋势。结果见图1。

图1白花蛇舌草对HT-29细胞形态的影响

2.3 HT-29细胞Bcl-2和Bax的表达

HT-29细胞经不同浓度白花蛇舌草提取物处理24h后,Bcl-2 mRNA和蛋白的表达随浓度增加而减少,Bax mRNA和的蛋白的表达随浓度增加而增多,呈现明显的剂量依赖。结果见图2。

(注:a. mRNA表达;b.蛋白表达)

图2白花蛇舌草对HT-29细胞Bcl-2、Bax表达的影响

3讨论

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤,近年来发病率呈上升趋势,严重威胁着人类的生命。虽然以外科手术为主的综合治疗有很大的提高,但其5年生存率仍然不高,尤其是中晚期患者目前仍缺少有效的治疗方法。因此,寻求新的有效的辅助防治方法和有效的治疗药物已成为肿瘤研究工作者面临的重要任务之一。而天然药物治疗各种肿瘤的副作用相对较少,因此,从天然药物中寻找有效的抗肿瘤治疗药物成为了当前肿瘤治疗研究的热点。

细胞过度增殖与细胞凋亡失调是各种肿瘤发生的最主要原因。细胞凋亡是一种自主性的程序死亡过程,并对维持生物体内环境的稳定起着重要作用。肿瘤细胞的凋亡与化疗、放疗以及治疗药物的敏感性密切相关,因此抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡是抗肿瘤研究的热点。肿瘤细胞凋亡是复杂的生物学过程,受到一系列的基因调控,其中Bcl-2是参与凋亡调控的基因家族。Bcl-2和Bax是凋亡家族的重要成员,在凋亡调控中起着重要作用。Bcl-2在线粒体上可调节线粒体膜的通透性,以阻止细胞色素C释放入胞质而抑制细胞凋亡;Bax可直接结合到线粒体膜上,改变膜的通透性,引起细胞色素C释放入胞浆,激活Caspase家族引起凋亡[4]。Bax可与Bcl-2结合形成异二聚体,抑制Bcl-2的抗凋亡作用,从而促进细胞凋亡,因此Bax与Bcl-2二者之间的比例对细胞的凋亡调控起着决定性作用。

白花蛇舌草具有清热解毒、活血化淤等功效,目前广泛应用于多种肿瘤的临床治疗,并在对消化、呼吸、血液等系统的恶性肿瘤治疗中取得了较好的疗效。现代研究表明[5-7],其主要化学成分有熊果酸、免疫多糖、乌索酸、白花蛇舌草素等,这些主要的有效成分具有增强免疫活性、抗氧化和抗肿瘤活性。临床应用报道也显示白花蛇舌草对结肠癌术后的辅助治疗有显著的疗效[8,9]。故本研究应用白花蛇舌草进行抗结肠癌HT-29细胞的研究。研究发现,体外培养的HT-29经不同浓度(1、3、5mg/ml)的白花蛇舌草作用24h后,经MTT法检测结果显示随着白花蛇舌草提取物给药剂量的增加对HT-29细胞的抑制作用也随之增强,并且在倒置显微镜下观察到细胞形态也发生明显的改变,细胞生长受到抑制,出现贴壁细胞明显减少,细胞变圆,由贴壁而脱落,浮悬于培养液中;白花蛇舌草提取物对HT-29细胞Bcl-2的mRNA和蛋白表达具有明显的抑制作用,明显上调Bax的mRNA与蛋白的表达。结果表明白花蛇舌草可能是通过抑制Bcl-2的表达和促进Bax的表达诱导HT-29细胞凋亡,从而抑制结肠癌HT-29细胞的增殖,具有显著的量效关系。本研究为临床应用白花蛇舌草治疗结肠癌提供了理论依据,但本实验中所用的白花蛇舌草为白花蛇舌草乙醇提取物,白花蛇舌草提取物是一种混合物,其抗肿瘤作用活性成分和诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制有待进一步研究。

参考文献:

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