烤烟品种K326及其耐低温抗早花变异系基因表达谱分析

材料中成千上万个基因的表达情况[7]。朱素琴等[8]利用Affymetrix水稻表达谱芯片，分析了高盐低温胁迫下水稻转录因子基因的表达谱。宋雯雯等[9]利用基因芯片技术，研究在不同干旱胁迫时间下强抗旱品种晋豆23幼苗根部基因的表达情况。许州达等[10]在分析了小麦与水稻基因的同源性后，利用水稻的基因芯片检测了小麦耐旱的相关基因的表达。曾黎琼等[11]通过GenBank搜索已发布的花序发育基因序列，设计特异性的引物，采用PCR法扩增，获得了相应的基因片段后利用这些基因片段制备基因芯片，然后用此芯片与已标记的非洲菊cDNA杂交，用以分析同一基因在非洲菊不同发育时期的表达情况和同一基因在不同肥料条件下的表达情况。本研究利用上海伯豪生物技术有限公司Agilent烟草全基因组表达谱芯片，对烟草早花与抗早花基因的表达进行分析。

1 材料与方法

1.1试验材料及种植

本试验选用烤烟（Nicotiana tabacum L.）品种K326及其变异系华烟06作为试验材料。K326易出现早花，华烟06则表现出明显的抗早花优势。为了使低温胁迫效果显著，早花与抗早花的差异表现更明显，试验比常规生产提前20 d播种（2011年11月15日），提早移栽（2012年2月5日），并于移栽后第20天开始对K326和华烟06茎尖端进行花芽分化观察，每3 d采一次样，采样时间为8：00，分别取3个茎尖端作为重复，记录样品采集时间及花芽分化情况，采集至观测到华烟06花芽分化，并记录现蕾时间。所采样品用液氮固定后-80℃保存备用，用于芯片检测的样品采集时间及材料标记如图1。

1.2 RNA的抽提和纯化

采用TRIZOL Reagent（Cat#15596-018， Lifetechnologies， Carlsbad， CA，US），抽提所得total RNA质检合格后使用RNeasy mini kit（Cat#74106， QIAGEN， GmBH，Germany）和 RNase-Free DNase Set（Cat#79254， QIAGEN， GmBH，Germany）纯化。试验样品RNA采用试剂盒Low Input Quick Amp Labeling Kit， One-Color （Cat#5190-2305， Agilent technologies， Santa Clara， CA， US）和标准操作流程对样品total RNA中的mRNA进行放大和标记，用RNeasy mini kit（Cat#74106， QIAGEN， GmBH， Germany） 纯化标记后的cRNA。

1.3 芯片杂交扫描

按照Agilent表达谱芯片配套提供的杂交标准流程和配套试剂盒，Gene Expression Hybridization Kit（Cat#5188-5242， Agilent technologies， Santa Clara， CA， US）杂交，并在洗缸staining dishes （Cat#121， Thermo Shandon， Waltham， MA，US）中洗片。完成杂交的芯片采用Agilent Microarray Scanner（Cat#G2565CA，Agilent technologies， Santa Clara， CA， US）进行扫描。

1.4 基因芯片数据分析

扫描数据采用Gene Spring Software 11.0（Agilent technologies， Santa Clara， CA， US）进行归一化处理，所用的算法为Quantile。归一化的数据根据试验设计两两比较，计算倍数差异Fold Change（FC）=SignalA/ SignalB，算法为2（归一化A-归一化B）。登陆上海伯豪生物服务在线网站

（http：//），利用在线SAS系统进行数据分析。通过GO（Gene Ontology）分析对两倍以上的差异表达基因进行功能注释和富集分析。

1.5 荧光定量PCR验证

利用烟草Actin基因（AB158612）为内参，从基因芯片分析结果中随机挑选出5个与开花相关的基因，进行实时荧光定量PCR，荧光定量PCR所用材料与基因芯片的材料及处理方式完全一样。3次重复，反应条件为95℃，10min；接着进行40个循环：95℃，15秒；60℃，30 s。算法为log2 2-∆∆ Ct。

2 结果

2.1 芯片数据验证

试验中K326于4月11日现蕾，华烟06于4月24日现蕾，二者现蕾时间相差13 d。为了验证芯片分析结果，随机挑选了5个与开花有关并具有代表性的差异基因（CCR2，ELF4，AGL20，CBF1，COL9）进行荧光定量PCR验证，结果表示芯片表达谱信息具有较高的可靠性。

2.2芯片扫描结果中差异探针数的基本特征

按照两倍以上（FC>2或FC<0.5）差异为有效差异的标准筛选差异探针，将基因表达情况分别进行纵向比较和横向比较。纵向比较为K326和华烟06各自花芽分化过程中茎尖端基因表达情况的比较；横向比较包括：K326和华烟06距离各自花芽分化19 d时茎尖端基因表达情况的比较；K326花芽分化当天，K326与华烟06的比较；花芽分化时K326茎尖端基因表达情况与华烟06的比较（表1）。

2.3纵向比较中差异基因的功能分类及富集分析

华烟06中与分子功能相关的差异表达基因可分为13类，而K326只有12类，其中少了蛋白标签（protein tag）；华烟06中与细胞组分相关的差异基因有9类，K326有10类，多了与共质体（symplast）相关的基因（表2）。

K326花芽分化过程中，未分化与分化相比，分子功能中显著富集的差异基因主要与催化性能、转运性能、结合性能和转录调节性能有关，这与华烟06一致；K326花芽分化与分化后5 d相比，除了与催化性能、转运性能、结合性能和转录调节性能有关的基因在茎尖端显著富集之外，与酶调节活性、营养贮存活性有关的基因也显著富集；与细胞组成相关的显著富集的基因有胞外区、细胞、细胞器及细胞组分相关的基因等（图2）。

K326和华烟06花芽分化过程中与生物学过程相关的基因分类共有24种，通过极显著富集筛选出16种，其中包括发育过程、刺激应答、生殖过程等（表3）。

2.4 横向比较中差异基因的功能分类与富集分析

K326和华烟06距离各自花芽分化天数相同、花芽未分化的茎尖端基因表达情况相比，与分子功能相关的显著富集的基因主要与催化性能、转运性能、结合性能和转录调节性能相关，K326分化当天与华烟06相比，与催化性能、转运性能、结合性能和转录调节性能相关的差异基因显著富集，K326、华烟06花芽分化时的差异表达基因中，与催化性能、转运活性、结合性能、转录调节性能、分子转导活性有关的基因显著富集；K326和华烟06距离各自花芽分化相同天数的差异表达基因中，与细胞组成相关的显著富集的基因主要与细胞、细胞器、细胞组分、胞外区组分、胞外区相关，K326分化当天，与胞外区、细胞、细胞组分相关的基因显著富集（图3）。

3 讨论

试验结果表明，在低温诱导下，K326移栽后65 d即开始现蕾，而华烟06则表现出了明显的抗早花特性，移栽后60 d才开始花芽分化。植物对环境刺激高度敏感，Lee等[12]的研究结果表明，即便是短时期的触碰和黑暗处理也会导致植物基因芯片检测结果存在较大差异。从本试验的比较结果看，K326与华烟06花芽均未分化且距离各自花芽分化时间相同点相比的差异探针数最多，达到5295个，而K326分化当天，二者之间相比差异探针数量最少，差异探针数为2116个，这说明基因表达差异不仅与植株的生长发育时期及遗传因素有关，更多的表达可能与气温及日照长短有关。

各品种（品系）生长发育过程中，分子功能、细胞组成、生物学过程相关的差异基因数量虽有一定差异，但分布比例是一致的，这说明K326与华烟06生长发育过程中基因总体的调控机制是相似的，这说明调控不同烤烟品种（品系）生长的基本机理相近，是否具有耐低温抗早花特性取决于少量特殊基因的表达。

为了进一步了解花芽分化过程中基因的表达变化及调控机制，有必要对差异基因进行显著和极显著富集分析，以确定差异表达基因行使的主要生物功能及其对植株花芽形成所具有的影响[13]。虽然K326花芽分化当天的差异基因数量最少，但通过显著富集分析，与营养储蓄相关的差异基因显著富

集，这可能与植株的生长发育状态有密切关系。从与细胞组成相关的差异基因的显著富集分析看，K326花芽分化与分化后5 d相比的差异基因的分类要多于其未分化与分化时相比的差异基因分类；而华烟06花芽未分化1与花芽未分化2相比，与细胞组成相关的差异基因种类要比未分化2与分化时相比的多，调控细胞生长的基因的表达有待进一步研究。

4结论

本试验通过比较分析，初步了解了K326及其抗早花品系花芽分化过程中基因的调控及表达机制。与分子功能相关的差异基因主要与催化性能、转运性能、结合性能和转录调节性能有关；与细胞组成相关显著富集的差异基因主要是与细胞、细胞组分、细胞器相关的基因；与生物学过程相关的差异基因种类最多最复杂，涉及到植株抗逆性、生长、发育等方面，这可为进一步研究并从中搜寻与烟草开花相关的基因提供参考依据。

参考文献

[1]SteinbergRA. Premature blossoming ：effects of vernalization，seedling age and environment on subsequent growth and flowering of transplanted tobacco [J]. Plant Physiology ，1952，27（4）：745-753.

[2] 张国，朱列书，王奎武，等. 烟草早花研究进展[J]. 作物研究，2005（5）：383-385.

[3] 种康，雍伟东，谭克辉. 高等植物春化作用研究进展[J].植物学通报，1999，16（5）：481-487.

[4] Yanofsky M F， Ma H， Bowman J L， et al. The protein encoded by the Arabidopsis homeotic gene agamous resembles transcription factors. Nature， 1990， 346：35-39.

[5] HorvathDP. Common mechanisms regulate flowering and dormancy[J]. Plant Science，2009，177（6） ：523-531.

[6] Matsuda N， Ikeda K， Kurosaka M， et al. Early flowering phenotype in transgenic pears （Pyrus communis L.）expressing the CiFT gene[J].Japan.Soc.Hort.Sci，2009，78 （4）： 410-416.

[7] 许志茹，李玉花. 基因芯片技术在植物研究中的应用[J].生物技术，2004，14（6）：70-72.

[8] 朱素琴，季本华，陈名蔚. 高盐低温胁迫下水稻转录因子基因表达谱分析[J]. 科技通报，2010，26（6）：844-852.

[9] 宋雯雯，李文滨，韩雪. 干旱胁迫下大豆幼苗根系基因的表达谱分析[J]. 中国农业科学，2010，43（22）：4579-4586.

[10] 许州达，景瑞莲，甘强，等. 用水稻基因芯片筛选小麦耐旱相关基因[J]. 农业生物技术学报，2007，15（5）：821-827.

[11] 曾黎琼，张伟，段玉云，等. 利用基因芯片分析非洲菊花序发育相关基因的表达[J]. 西南农业学报，2009，22（3）：759-763.

[12] Lee D， Polisensky D H，Braam J.Genome-wide identification of touch and darkness-regulated arabidopsisgenes：a focus on calmodulin-like andXTHgenes[J]. New Phytologist，2005，165（2）：429-444.

[13] 刘明，王米渠，丁维俊，等. 表达谱芯片数据的基因功能富集分析[J]. 生物医学工程学杂志，2010，27（5）：1166-1168，1196.