嗜热真菌木聚糖酶1YＮA的表达和定点突变

2022-03-04 08:30:39 | 浏览次数：

摘要：为了进一步提高嗜热真菌（ＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓＤＳＭ１０６３５）本已较耐热的木聚糖酶１ＹＮＡ的热稳定性。利用重叠延伸ＰＣＲ技术从嗜热真菌基因组ＤＮＡ中扩增获得了木聚糖酶１ＹＮＡ的基因ｘｙｌ，将其插入到大肠杆菌表达载体ｐＥＴ－２２ｂ（＋）中，构建了重组表达质粒ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ｘｙｌ。该质粒转化到表达宿主大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）后获得了能成功表达的工程菌。工程菌表达木聚糖酶１ＹＮＡ的最适温度为６５℃，最适ｐＨ值为６．０。其在７５℃，ｐＨ值为６．５的条件下失活处理３０ｍｉｎ后还残存有３０％的酶活，与嗜热真菌生产的木聚糖酶特性相近。在对该木聚糖酶的Ｎ端氨基酸序列进行定点突变后发现，Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｇ、Ｔ４Ｒ均对该木聚糖酶的热稳定性无显著影响，其中Ｔ４Ｇ突变体的耐热性有变弱的趋势。

关键词：嗜热真菌；重叠延伸ＰＣＲ；定点突变；木聚糖酶

中图分类号：Ｑ９３９．５；Ｑ７８文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）07－1488-06

Characterization and Site-directed Mutagenesis of Xylanase 1YNA from

Thermomyces lanuginosus DSM10635

ＦＵＺｈｅｎｇ１，ＺＨＡＮＧＨｕａ－ｓｈａｎ２，ＺＥＮＧＸｉａｏ－ｙｉｎｇ１，ＸＩＯＮＧＨａｉ－ｒｏｎｇ１

（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，Ｓｏｕｔｈ－ｃｅｎｔｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｆｏｒＮａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ，Ｗｕｈａｎ４３００７３，Ｃｈｉｎａ；

２．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＨｕｂｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ４３００６８，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎＰＣＲｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｗａｓｕｓｅｄｔｏａｍｐｌｉｆｙｘｙｌａｎａｓｅ１ＹＮＡｇｅｎｅｘｙｌｆｒｏｍＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓＤＳＭ１０６３５．ＴｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｃｏｎｎｅｃｔｅｄｗｉｔｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＴ－２２ｂ（＋）ｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌｖｅｃｔｏｒ

ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ｘｙｌ；ａｎｄｔｈｅｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｈｏｓｔＢＬ２１（ＤＥ３）．Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｘｙｌａｎａｓｅ１ＹＮＡｗａｓ６５℃，ｐＨ６．０．Ｔｈｅｘｙｌａｎａｓｅｒｅｍａｉｎｅｄ３０％ｏｆａｃｔｉｖｉｔｙａｆｔｅｒ３０ｍｉｎｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｔｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｐＨ６．５，７５℃．ＡｆｅｗＮ－ｔｅｒｍｉｎｕｓａｍｉｎｏａｃｉｄｓｏｆｘｙｌａｎａｓｅ１ＹＮＡｗｅｒｅｃｈａｎｇｅｄｂｙｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．ＴｈｅｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｘｙｌａｎａｓｅｍｕｔａｎｔｓＴ４ＡａｎｄＴ４Ｒｗａｓｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈｅｉｒｐａｒｅｎｔ，ｗｈｉｌｅＴ４Ｇｓｈｏｗｅｄｗｅａｋｅｒｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ；ｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎＰＣＲ；ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；ｘｙｌａｎａｓｅ

木聚糖酶（Ｘｙｌａｎａｓｅ，ＥＣ３．２．１．８）是可将木聚糖降解成低聚木糖和少量木糖的一类酶的总称。狭义上的木聚糖酶限指内切β－１，４－木聚糖酶，是木聚糖降解过程中最关键的一个酶［１－３］。木聚糖酶在现代工业中的重要性越来越明显。目前该酶主要应用于制浆造纸、饲料和食品等行业。木聚糖酶用于制浆造纸行业的预处理可提高纸浆的白度和减少化学漂白剂的使用；用于饲料行业能增加饲料的利用率和减少动物胃肠道疾病的发生；用于食品行业主要是对小麦面粉的改良和在酿酒方面的应用等。木聚糖酶是利用非淀粉质原料生产酒精过程中的一个关键酶。随着生物质能源事业发展，木聚糖酶必将得到更广泛的应用。

自１９８３年Ｂｅｒｎｉｅｒ等首次从Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ中分离得到木聚糖酶基因以来，许多来自细菌、放线菌、霉菌、酵母菌和藻类等不同生物的木聚糖酶基因被克隆表达和分析。嗜热真菌Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ产生的木聚糖酶由于其高耐热性越来越受到关注［４］。嗜热真菌Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓＤＳＭ１０６３５是从捷克的土壤中分离得到的一株耐热型菌株，它产生的木聚糖酶是一种耐高温酶，在较高温度（５０～８０℃）条件下稳定。Ｘｉｏｎｇ等［５］对该嗜热真菌ＤＳＭ１０６３５所分泌的木聚糖酶进行了详细的研究。该木聚糖酶属于糖基水解酶第１１家族，其最适ｐＨ值为６．０，最适温度为７０℃，并且在ｐＨ值为５．５～９．０下都具有很高的酶活性。质谱结果还表明嗜热真菌ＤＳＭ１０６３５产生的木聚糖酶的分子量为２１２９５．１７Ｄａ，与ＤＳＭ５８２６产生的木聚糖酶（１ｙｎａ）的分子量极为相近。

耐高温酶的应用前景广阔。在使用酶制剂的工业大生产中，高温过程常常不可避免或对工艺有帮助，例如高温能加快生化反应速度，提高液体物料的流动性能，防止有害微生物在过程中的生长繁殖等，目前大规模使用的酶制剂主要是通过工程菌发酵获得的。基于ＰＣＲ技术的不断发展和完善，运用基因工程和蛋白质工程的方法对木聚糖酶基因进行操作已经非常普遍［６－１２］。定点突变改变木聚糖酶分子的氨基酸残基能导致酶特性的改变［１３－１７］。目前的研究多聚焦于第１１家族的中温木聚糖酶，并且通过定点突变等方法获得了许多较耐热的突变体［１８－２０］。总体来说，这些中温木聚糖酶的突变体热稳定性并未达到满意的程度，大多数突变体的热稳定性仅仅与未修改的耐热木聚糖酶的热稳定性接近。直接利用本身已较耐热的木聚糖酶为模板进行基因修改将极有可能获得更耐热的突变体。

本研究对嗜热真菌Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓＤＳＭ１０６３５的木聚糖酶１ＹＮＡ进行了原核表达。由于此木聚糖酶基因中只含有一个内含子，实验中没有采用获得木聚糖酶基因的ＲＮＡ后逆转录得到ｃＤＮＡ的方法来获得木聚糖酶的编码基因，而是利用特异性引物进行重叠延伸ＰＣＲ获得的木聚糖酶１ＹＮＡ编码基因，然后将其与原核表达载体连接后转入宿主菌能诱导表达木聚糖酶。文献查询没有关于木聚糖酶１ＹＮＡ的基因表达的报道，本文是首次对该耐热木聚糖酶进行表达和基因定点修改，为今后实验工作的进一步开展打下了基础和指明了方向。

１材料与方法

１．１实验材料

嗜热真菌ＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓＤＳＭ１０６３５购自德国微生物菌种保藏中心（ＤＳＭＺ）。克隆载体ｐＧＥＭＴ－ｅａｓｙ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。表达载体

ｐＥＴ－２２ｂ（＋）购自Ｎｏｖａｇｅｎ公司。大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＤＨ５α来自中国农业科学院饲料研究所实验室。实验所用的限制性内切酶ＮｃｏⅠ、ＸｈｏⅠ，Ｔ４ＤＮＡ连接酶，ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡ聚合酶，ＴａｑＤＮＡ聚合酶，ＤＮＡ回收试剂盒，质粒提取试剂盒均购自ＴａＫａＲａ公司。木聚糖购自Ｓｉｇｍａ公司，其他化学试剂均为国产分析纯。

１．２实验方法

１．２．１木聚糖酶基因ｘｙｌ的克隆参考ＧｅｎＢａｎｋ中嗜热真菌Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓＤＳＭ５８２６（登录号Ｕ３５４３６）的木聚糖酶基因序列及相关的Ｇ１１家族的木聚糖酶基因序列来进行序列比对分析，从而设计特异性的简并引物ｆ１，ｆ２和ｒ（表１）对总ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，这些引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物ｆ１是根据木聚糖酶基因的起始位点前面一段序列设计的，而引物ｆ２是根据木聚糖酶基因中间一段相对保守序列设计的。将纯化后的ＰＣＲ产物与ｐＧＥＭＴ－ｅａｓｙ连接后转化ＤＨ５α感受态细胞，挑选阳性克隆子送去北京擎科生物技术有限公司测序。

１．２．２木聚糖酶１ＹＮＡ的原核表达对ｆ１－ｒ，ｆ２－ｒ两种引物对的ＰＣＲ产物的测序结果进行序列比对。结果表明，此木聚糖酶基因只含有一个约１００ｂｐ的内含子。设计含有酶切位点的特异性引物对ｆ１－ｒ引物对的PCR产物进行重叠延伸ＰＣＲ，ＰＣＲ扩增条件为：９４℃、５ｍｉｎ；９４℃、３０ｓ，６７℃、３０ｓ，７２℃、４０ｓ，循环３０次；７２℃、１０ｍｉｎ；４℃保存。经过两轮ＰＣＲ后得到含有酶切位点ＮｃｏⅠ和ＸｈｏⅠ的ＰＣＲ产物ｘｙｌ片段，此片段和经两种内切酶切割后的ｐＥＴ－２２ｂ（＋）空质粒载体在Ｔ４ＤＮＡ连接酶的作用下连接为重组质粒ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ｘｙｌ，电击转化感受态细胞ＢＬ２１（ＤＥ３），涂布于含１００ μｇ／ｍＬ氨苄青霉素（简称Ａｍｐ）的ＬＢ固体平板后，挑选阳性克隆子培养，以进行木聚糖酶酶活的初步测定，显示有酶活的克隆子送去南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

１．２．３木聚糖酶突变体Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｇ、Ｔ４Ｒ的原核表达通过对原核表达的木聚糖酶的氨基酸序列进行分析，可以对其Ｎ端的某个氨基酸进行定点突变获得高稳定性的木聚糖酶突变体，设计引物将其第４位的苏氨酸突变为丙氨酸（引物ｄＦ１）、甘氨酸（引物ｄＦ２）或精氨酸（引物ｄＦ３），改变其Ｎ－端的疏水性来提高其热稳定性，利用定点突变引物和反向引物对提取的质粒ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ｘｙｌ进行扩增。ＰＣＲ的条件是：９４℃、５ｍｉｎ；９４℃、３０ｓ，６７℃、３０ｓ，７２℃、１ｍｉｎ，循环３０次；７２℃、１０ｍｉｎ；４℃保存。将纯化后的ＰＣＲ定点突变产物和经限制性内切酶ＮｃｏⅠ和ＸｈｏⅠ消化后的ｐＥＴ－２２ｂ（＋）空质粒载体在Ｔ４ＤＮＡ连接酶的作用下构建ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ｘｙｌ突变重组质粒。４２℃热激转化感受态细胞ＢＬ２１（ＤＥ３），涂布于含１００ μｇ／ｍＬＡｍｐ的固体平板后过夜培养，挑选阳性克隆子进行５０ｍＬ摇瓶培养并进行诱导，用３，５－二硝基水杨酸（ＤＮＳ）法初步测定其是否具有酶活，有木聚糖酶表达的克隆子送去南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

１．２．４木聚糖酶１ＹＮＡ及其突变体Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｇ、Ｔ４Ｒ的酶液制备将在ＬＢ（含１００ μｇ／ｍＬ的Ａｍｐ）固体平板上活化生长的单克隆子接入含有ＬＢ培养基（Ａｍｐ的浓度为１００ μｇ／ｍＬ）的１．５ｍＬ离心管，摇床培养４ｈ后按１％（ｍ／ｍ）的比例接入到１００ｍＬＬＢ培养基中，３７℃，２００ｒ／ｍｉｎ摇床过夜，加入终浓度为０．１ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ溶液诱导培养４８ｈ。培养液４℃，８０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ后取上清加入硫酸铵至其达到８０％的饱和度，５０００ｒ／ｍｉｎ离心０．５ｈ后沉淀用５０ｍｍｏｌ／Ｌ的柠檬酸－磷酸缓冲液（ｐＨ值为６．５）溶解，８０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ后取上清４℃保存备用。

１．２．５木聚糖酶酶特性的鉴定实验采用ＤＮＳ法测定木聚糖酶的酶活。一个酶活力单位的定义为：在６０℃和ｐＨ值为６．５的条件下，每分钟水解木聚糖底物产生１ μｍｏｌ木糖所需酶量为１个国际酶活力单位。酶活的测定以Ｄ－木糖作为标准。在木聚糖酶酶活测定的实验中，ｐＨ值为４～７用的是柠檬酸－磷酸缓冲液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ）；ｐＨ值为７～９用的是Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ）。木聚糖酶特性的鉴定主要包括最适温度、最适ｐＨ值和热稳定性的测定。每个结果均为３个平行样的平均值。①最适反应温度的测定。０．２ｍＬ稀释好的酶液与１．８ｍＬ０．５％

（m／Ｖ，ｇ／ｍＬ，下同）木聚糖底物在不同的温度下反应１０ｍｉｎ，然后加入３ｍＬＤＮＳ煮沸５ｍｉｎ。最适温度的测定分别在两个ｐＨ值下进行。②最适反应ｐＨ值的测定。在相同的温度下，０．２ｍＬ稀释好的酶液与不同ｐＨ值的１．８ｍＬ的木聚糖底物缓冲液反应１０ｍｉｎ，然后加入３ｍＬＤＮＳ溶液煮沸５ｍｉｎ。③热稳定性的测定。用同一ｐＨ值的缓冲液稀释好的酶液在不同的温度（５０～１００℃）下失活处理３０ｍｉｎ，然后取失活后的０．２ｍＬ酶液与１．８ｍＬ的０．５％木聚糖底物（ｐＨ值为６．５）在６０℃下反应１０ｍｉｎ，再加入３ｍＬＤＮＳ混匀后煮沸５ｍｉｎ。热稳定性的测定在３个ｐＨ值下进行。所有样品在５４０ｎｍ下测定其吸光度值。

２实验结果

２．１重叠延伸ＰＣＲ的结果

选择合适的ＰＣＲ体系对提取的总ＤＮＡ进行扩增，ｆ１－ｒ和ｆ２－ｒ两种引物对进行ＰＣＲ后获得比较好的结果，分析两个产物的测序结果发现ｆ１－ｒ这对引物ＰＣＲ扩增后的产物长度比ｆ２－ｒ的产物长，即ｆ２－ｒ的ＤＮＡ序列包含在ｆ１－ｒ的ＤＮＡ序列中，与实验预期的结果基本符合。在ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡ聚合酶作用下，采用不同特异性引物组合（ｍＦ，ｍＲ，ｚＦ，ｚＲ）对ｆ１－ｒ引物ＰＣＲ的产物进行重叠延伸ＰＣＲ（图１），结果显示ＰＣＲ产物的ＤＮＡ长度分别约为２００ｂｐ和４００ｂｐ（图２泳道２、３）。将两种纯化后的ＰＣＲ产物加入到含有ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡ聚合酶和引物（ｍＦ，ｍＲ）的体系中进行ＰＣＲ扩增。获得６００ｂｐ左右的ＤＮＡ片段，这就是目的片段ｘｙｌ（图２泳道４）。

２．２重组表达质粒的构建及验证

将经过测序验证的木聚糖酶基因ｘｙｌ以正确的开放阅读框连接到原核表达载体ｐＥＴ－２２ｂ（＋）上，获得重组表达质粒ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－ｘｙｌ（图３），转化大肠杆菌感受态细胞ＢＬ２１（ＤＥ３），挑选阳性克隆子培养，用试剂盒提取其质粒ＤＮＡ，经限制性内切酶ＮｃｏⅠ和ＸｈｏⅠ双酶切后得到与ｐＥＴ－２２ｂ（＋）（空质粒双酶切后的片段）以及目的基因ｘｙｌ大小相符的ＤＮＡ片段（图４），说明木聚糖酶基因ｘｙｌ已正确插入到原核表达载体ｐＥＴ－２２ｂ（＋）上。

２．３木聚糖酶１ＹＮＡ及其酶突变体Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｇ、Ｔ４Ｒ的酶特异性鉴定

２．３．１木聚糖酶１ＹＮＡ的酶特异性鉴定木聚糖酶１ＹＮＡ最适温度的测定在ｐＨ值为５．０和６．５下进行，两个ｐＨ值条件下都是在６５℃反应１０ｍｉｎ时相对酶活达到最大值，因此确定原核表达木聚糖酶１ＹＮＡ的最适温度为６５℃（图５）。木聚糖酶１ＹＮＡ的最适ｐＨ值为６．０。在５０、７０℃的反应条件下，木聚糖酶在ｐＨ值为６．０时都具有相对比较大的酶活（图６）。木聚糖酶１ＹＮＡ的失活曲线显示其在ｐＨ值为６．５和８．０下稳定性比ｐＨ值为５．０要高些（图７），在ｐＨ值为５．０的环境下，木聚糖酶６０℃处理３０ｍｉｎ后只残留约７０％的相对酶活，而经过相同的失活处理后，ｐＨ值为６．５和８．０条件下的相对残留酶活基本没有下降；在６５℃处理３０ｍｉｎ后，不同ｐＨ值下的差别更明显，在ｐＨ值为６．５和８．０条件下的相对残留酶活还有８０％以上，而在ｐＨ值为５．０的环境下１ＹＮＡ只剩下约４０％的相对残留酶活；木聚糖酶１ＹＮＡ在ｐＨ值为５．０，１００℃下处理３０ｍｉｎ后基本丧失所有酶活，而相同条件处理后在ｐＨ值为６．５和８．０环境下还残留有少部分酶活。

２．３．２木聚糖酶突变体Ｔ４Ａ，Ｔ４Ｇ，Ｔ４Ｒ的热稳定性鉴定实验成功完成了将木聚糖酶１ＹＮＡ的第４位苏氨酸基因定点突变为丙氨酸（Ｔ４Ａ）、甘氨酸（Ｔ４Ｇ）或精氨酸（Ｔ４Ｒ），并对突变结果进行了表达。表达产物均有木聚糖酶活力。对木聚糖酶突变体Ｔ４Ａ，Ｔ４Ｇ，Ｔ４Ｒ进行了热稳定性的测定（图８～１０）。在ｐＨ值为５．０的环境下，６０℃热处理３０ｍｉｎ后，木聚糖酶突变体Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｇ、Ｔ４Ｒ的相对残留酶活分别为７６．６１％，５１．９４％和６２．４８％。而在ｐＨ值为６．５和８．０环境下３种突变酶的相对残留酶活基本没有变化；３种突变酶在ｐＨ值为５．０的环境下，６５℃热处理３０ｍｉｎ后就基本丧失所有酶活，但在ｐＨ值为６．５和８．０环境下３种酶表现出不一样的热稳定性，Ｔ４Ａ的相对残留酶活分别是７２．２１％和６６．２９％，Ｔ４Ｇ的相对残留酶活最低，分别是６０．２８％和５５．７４％，Ｔ４Ｒ的相对残留酶活分别是６５．２７％和６０．６１％。总的来说，３种突变酶在ｐＨ值为６．５和８．０下的热稳定性都高于ｐＨ值为５．０下的热稳定性。

３讨论

本研究以产耐热木聚糖酶的嗜热真菌Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓＤＳＭ１０６３５为实验材料，克隆了其木聚糖酶基因ｘｙｌ并进行了原核表达。该木聚糖酶基因的编码序列含有５８８个碱基，共编码１９６个氨基酸。从实验所得的结果我们可以看出，利用重叠延伸ＰＣＲ的方法获得木聚糖酶１ＹＮＡ的蛋白质编码序列是完全可行的，并且取得比较好的效果，这样做比用传统方法更容易获得编码序列。传统方法获得具有内含子的基因编码区主要是通过提取ｍＲＮＡ再经过逆转录酶反应得到ｃＤＮＡ，这种方法有一定的弊端，首先提取ｍＲＮＡ的提取过程比较繁琐，最主要原因是提取液中目的ｍＲＮＡ的含量较少而且容易被广泛存在的ＲＮＡ酶降解。重叠延伸ＰＣＲ以前多用于两个基因的连接（如融合蛋白）和蛋白质中间区域某个氨基酸的突变，此外还可以用于多个外显子的拼接。陆长梅等［１３］设计重叠延伸引物，从Ｔ．ｒｅｅｓｅｉＱＭ９４１４基因组ＤＮＡ中通过ＰＣＲ方法获得４个外显子，然后再通过重叠延伸ＰＣＲ方法将４个外显子按顺序一个个拼接，通过８次ＰＣＲ反应就成功获得了与ＧｅｎＢａｎｋ上外显子序列完全一样的成熟ｘｙｎⅢ的ｃＤＮＡ序列。对于只含有少数内含子的基因，使用重叠延伸ＰＣＲ的方法获得其蛋白质编码序列更具有优越性。

由于缺少蛋白质糖基化修饰过程，原核表达的木聚糖酶在氨基酸序列没有变化的情况下其热稳定性一般要比嗜热真菌产生的木聚糖酶热稳定性低。本文的实验结果也证实了这个现象。通过比较大肠杆菌重组表达的木聚糖酶１ＹＮＡ与嗜热真菌ＤＳＭ１０６３５所分泌的原酶［３］发现，木聚糖酶１ＹＮＡ的最适温度比原酶约低５℃，最适ｐＨ值差别不大，其他酶特性比较相似。

通过定点突变技术，本文对原核表达的木聚糖酶１ＹＮＡ进行了单个氨基酸修改。第１１家族木聚糖酶的Ｎ端是基因突变位点较为集中的区域。由于该区域结构较为松散，从蛋白质数据库文件ＰＤＢ立体结构分析图能够观察到第４位的苏氨酸的羟基扰乱了Ｎ端肽链结构的完整性。我们尝试改变第４位的苏氨酸为其他不同氨基酸，探讨木聚糖酶１ＹＮＡ的热稳定性和Ｎ端结构的关联性。木聚糖酶突变体（Ｔ４Ａ，Ｔ４Ｇ，Ｔ４Ｒ）与１ＹＮＡ比较，热稳定性已经发生了变化但相对变化不大，其中Ｔ４Ｇ导致酶的耐热性有变弱的趋势。１ＹＮＡ在ｐＨ值为５．０下６０℃处理３０ｍｉｎ后还剩余约７０％的相对残留酶活，而Ｔ４Ａ在相同条件下处理后相对残留酶活剩余约８０％，Ｔ４Ｒ的相对残留酶活次之，为６０％左右，Ｔ４Ｇ的相对残留酶活最低，只达到５０％。３种木聚糖酶突变体在ｐＨ值为６．５和８．０下的热稳定性也低于１ＹＮＡ在ｐＨ值为６．５和８．０下的热稳定性。

对本身已较耐热酶蛋白质的结构进行修改以期进一步提高其热稳定性是一个挑战。本研究首次对耐热木聚糖酶１ＹＮＡ进行了表达和基因修改，为今后进一步研究该耐热木聚糖酶打下了基础和指明了方向。

参考文献：

［１］毛连山，勇强，宋向阳，等．内切木聚糖酶的选择性纯化及酶解制备低聚木糖的研究［Ｊ］．林产化学与工业，２００６，２６（１）：

１２４－１２６．

［２］ＲＡＮＩＤＳ，ＮＡＮＤＫ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅｃｅｌｌｕｌａｓｅ－ｆｒｅｅｘｙｌａｎａｓｅｂｙＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｂｓｏｎｕｍＣＦＲ－７０２［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｓｓＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０００，３６（４）：３５５-３６２．

［３］ＵＳＴＩＮＯＶＢＢ，ＧＵＳＡＫＯＶＡＶ，ＡＮＴＯＮＯＶＡＩ．ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄｍｏｄｅｏｆａｃｔｉｏｎｏｆｓｉｘｓｅｃｒｅｔｅｄｘｙｌａｎａｓｅｓｆｒｏｍＣｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ［Ｊ］．ＥｎｚｙｍｅａｎｄＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，４３（１）：５６-６５．

［４］ＳＩＮＧＨＳ，ＭＡＤＬＡＬＡＡＭ，ＰＲＩＯＲＢＡ．Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｓｔｒａｉｎｓａｎｄｔｈｅｉｒｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ［Ｊ］．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＲｅｖｉｅｗｓ，２００３，２７（１）：３－１６．

［５］ＸＩＯＮＧＨＲ，ＮＹＹＳＳ?魻Ｌ?魧Ａ，ＴＵＲＵＮＥＮＯ，ｅｔａｌ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｘｙｌａｎａｓｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｓｕｂｍｅｒｇｅｄｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｂｙＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓＤＳＭ１０６３５［Ｊ］．ＥｎｚｙｍｅａｎｄＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，３５（１）：９３－９９．

［６］李东峰，周晨妍，白剑宇，等．木聚糖酶融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达［Ｊ］．食品与发酵工业，２００７，３３（１１）：３９－４３．

［７］ＷＡＮＧＹＲ，ＺＨＡＮＧＨＬ，ＨＥＹＺ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇ，ａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｎｏｖｅｌｘｙｌａｎａｓｅＸＹＮＢｆｒｏｍＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｏｌｉｖａｃｅｏｖｉｒｉｄｉｓＡ１［Ｊ］．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，２００７，２６７（１－４）：３２８-３３４．

［８］ＲＯＢＥＲＧＥＭ，ＳＨＡＲＥＣＫＦ，ＭＯＲＯＳＯＬＲ，ｅｔａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｃｔｉｖｅ－ｓｉｔｅａｒｏｍａｔｉｃｒｅｓｉｄｕｅｓｉｎｘｙｌａｎａｓｅＡｆｒｏｍＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ［Ｊ］．ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９９，１２（３）：２５１-２５７．

［９］ＨＵＡＮＧＪＬ，ＷＡＮＧＧＣ，ＸＩＡＯＬ．Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｘｙｌａｎａｓｅｇｅｎｅｆｒｏｍａＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｓｔｒａｉｎＢ１０ｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ［Ｊ］．ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６，９７（６）：８０２－８０８．

［１０］ＳＲＩＶＡＳＴＡＶＡＰ，ＭＵＫＨＥＲＪＥＥＫＪ．Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｘｙｌａｎａｓｅｇｅｎｅｆｒｏｍＢａｃｉｌｌｕｓｌｙｔｉｃｕｓｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ［Ｊ］．ＰｒｅｐＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００１，３１（４）：３８９－４００．

［１１］ＮＡＳＣＩＭＥＮＴＯＲＰ，ＣＯＥＬＨＯＲＲＲ，ＭＡＲＱＵＥＳＳ，ｅｔａｌ．ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｐａｒｔｉａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎｏｆｘｙｌａｎａｓｅｆｒｏｍＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．ｓｔｒａｉｎＡＭＴ－３ｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＢｒａｚｉｌｉａｎｃｅｒｒａｄｏｓｏｉｌ［Ｊ］．ＥｎｚｙｍｅａｎｄＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００２，３１（４）：５４９-５５５．

［１２］ＫＵＬＫＡＲＮＩＮ，ＳＨＥＮＤＹＥＡ，ＲＡＯＭ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌａｓｐｅｃｔｓｏｆｘｙｌａｎａｓｅｓ［Ｊ］．ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＲｅｖ，１９９９，２３（４）：４１１－４５６．

［１３］陆长梅，袁生，赵庆新．用Ｏｖｅｒｌａｐ－ＰＣＲ法从ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉＱＭ９４１４基因组ＤＮＡ中克隆并表达木聚糖酶Ⅲ［Ｊ］．生物工程学报，２００４，２０（５）：７６４－７６９．

［１４］ＦＥＮＥＬＦ，ＬＥＩＳＯＬＡＭ，Ｊ?魧ＮＩＳＪ，ｅｔａｌ．ＡｄｅｎｏｖｏｄｅｓｉｇｎｅｄＮ－ｔｅｒｍｉｎａｌｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅｂｒｉｄｇｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｓｔｈｅＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉｅｎｄｏ－１，４－β－ｘｙｌａｎａｓｅＩＩ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４，１０８（２）：１３７–１４３．

［１５］ＭＯＥＲＳＫ，ＢＯＵＲＧＯＩＳＴ，ＲＯＭＢＯＵＴＳＳ，ｅｔａｌ．ＡｌｔｅｒａｔｉｏｎｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＸｙｎＡｅｎｄｏｘｙｌａｎａｓｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙｂｙｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．ＥｎｚｙｍｅａｎｄＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，４１（１－２）：８５-９１．

［１６］ＦＥＮＥＬＦ，ＺＩＴＴＩＮＧＡＪ，ＫＡＮＴＥＬＩＮＥＮＡ．ＩｎｃｒｅａｓｅｄａｌｋａｌｉｓｔａｂｉｌｉｔｙｉｎＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉｅｎｄｏ－１，４－β－ｘｙｌａｎａｓｅＩＩｂｙｓｉｔｅｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６，１２１（１）：１０２-１０７．

［１７］ＲＯＢＥＲＧＥＭ，ＤＵＰＯＮＴＣ，ＭＯＲＯＳＯＬＩＲ，ｅｔａｌ．Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ－１２７ｏｆｘｙｌａｎａｓｅＡｆｒｏｍＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ，ａｋｅｙｒｅｓｉｄｕｅｉｎｇｌｙｃｏｓｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅｓｏｆｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ４／７：Ｋｉｎｅｔｉｃｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒｉｔｓｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｉｎｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃａｔａｌｙｔｉｃｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ［Ｊ］．ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ，１９９７，１０（４）：３９９－４０３．

［１８］ＸＩＯＮＧＨＲ，ＦＥＮＥＬＦ，ＬＥＩＳＯＬＡＭ，ｅｔａｌ．ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｈｅｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉｅｎｄｏ－１，４－ｂｅｔａ－ｘｙｌａｎａｓｅＩＩｂｙｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅｂｒｉｄｇｅｓ［Ｊ］．Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅ，２００４，８（５）：３９３－４００．

［１９］周晨妍，李东峰，邬敏辰，等．木聚糖酶ＸｙｎⅡ的Ｄ３７Ｎ突变、表达及酶学性质变化［Ｊ］．生物加工过程，２００８，６（３）：６２－６７．

［２０］杨浩萌，柏映国，李江，等．木聚糖酶ＸＹＮＢ的Ｎ４６Ｄ突变、表达及酶学性质变化［Ｊ］．中国生物化学与分子生物学报，２００６，２２（３）：２０４－２１１．

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