CNVp,lex技术在自然流产检测中的应用

[摘要]目的：研究分析运用CNVplex高通量多重基因拷贝数检测技术对早期自然流产患者胚胎绒毛组织的染色体数目检测的临床价值。方法：在早期自然流产患者中随机抽取20例为研究对象，用CNVplex高通量多重基因拷贝数检测技术对患者胚胎绒毛组织的13号染色体、18号染色体、21号染色体及性染色体数目进行快速检测。结果：通过CNVplex技术与染色体核型分析技术的对比，20例中有2例由于细胞培养失败而无法进行核型分析，其他18例用两种方法检测出的结果一致；其中检测出染色体数目异常的有12例，占总比的60%。结论：CNVplex技术在自然流产胚胎绒毛组织的染色体数目异常诊断中具重要价值，为产前筛查及流产儿病因确认提供，临床参考。

[关键词]自然流产：CNVplex；染色体

自然流产是一种胚胎停止发育或胚胎死亡的妇产科常见疾病，其中胚胎停育自然流产的绒毛染色体异常率可达50%70%。CNVplex技术是一种双连接产物多重荧光PCR扩增技术，于同一反应管内可同时检出48-480个不同核苷酸序列拷贝数的变化。与“金标准”的染色体核型分析技术比较，CNVplex具有通量高、准确性高、分辨率高、重复性高、快速高效的特点。通过CNVplex检测方法针对每条染色体短、长臂区设计探针，通过检测这些区域的拷贝数变化就可以判断每条染色体数目的缺失和重复。现随机抽取自然流产患者共20例，对其进行CNVplex快速检测。

1资料与方法

1.1一般资料

从2013年12月到2014年12月在各医院治疗的早期自然流产患者中抽取20例为研究对象。年龄23-45岁的孕妇患者，孕龄在7-13周，其中有过1次流产患者为12例，有过2次流产的为3例，3次流产的为5例。

1.2检测方法

1.2.1标本取材

选择流产患者的胚胎绒毛组织，首先用生理盐水清洗干净；然后在解剖显微镜下将绒毛与蜕膜组织分开，取2mg样本用酚氯仿提取基因组DNA，并将DNA浓度标定至50ng/ul。

1.2.2 CNVplex检测

采用天昊生物医药科技（苏州）有限公司N1008人类24条染色体非整倍体检测试剂盒。连接反应、连接产物多重荧光PCR扩增、扩增产物荧光毛细管电泳分离均参考试剂盒说明书。PCR扩增产物用美国ABI公司ABl3 130XL进行毛细管电泳，原始数据文件采用GeneMapper4.1进行目标峰高的数据读取，进而对样本目的区域的拷贝数进行分析确定.

2结果

20例自然流产绒毛组织都在2周内进行了细胞培养，其中有18例核型分析成功，占比90%；由于获取绒毛组织时母血污染导致核型分析失败l例，占比5%；而由于活性细胞数量少，细胞活性差，而导致核型分析失败的1例，占比5%。20例自然流产绒毛组织都在3日内进行CNVplex检测（成功率为100%），核型分析失败的2例也得到结果。两种方法都检测成功的18例结果完全一致（100%）。通过比较不同次数流产患者的胚胎绒毛组织的染色体异常情况，发现随着流产次数的增加，染色体数目异常的风险也逐步增加。

3讨论

孕妇的早期流产大多数都是由胚胎组织染色体数目异常所致，并且流产的风险会随流产次数增加而增加。胚胎停育是一种严重影响妇女身心健康的疾病，发病率逐年上升，其发病原因非常复杂。目前国内外对胚胎停育的研究很多，大多数人认为导致自然流产的原因与遗传、男性精液异常、内分泌、免疫、感染、环境因素、理化因素等有关，另外还有相当一部分病因不明，其中遗传因素是导致自然流产最为重要的因素；其中，自然流产绒毛的染色体异常率可达50%～70%。

CNVplex的检测原理：利用双连接产物多重荧光PCR扩增原理，对染色体的拷贝数进行分析确定。其探针稳定可以长时间保存，研究表明其具有高效、准确、灵敏、快速等优点，现被广泛应用在基因诊断研究领域。

4结论

本次研究通过CNVplex技术检测早期流产患者染色体异常的情况，由检测值与常规染色体核型对比分析结果一致。在检测出染色体异常的12例患者中，三体异常的患者最多，有7例，占比58%，其次为X单体，占比25%。研究结果还表明，染色体异常随着产妇流产次数和孕龄的增大而增大。与核型分析相比，CNVplex技术在早期自然流产胚胎绒毛组织的染色体数目检测上具有实际临床应用价值，尤其对细胞培养失败的而无法进行核型分析的样本。对流产绒毛病因的检测分析，为指导孕妇再妊娠时提供依据与预防措施。