内毒素诱导大鼠心肌损伤时EPO及EPOR表达的实验研究

[摘要] 目的 观察内毒素诱导大鼠心肌损伤时EPO 及EPO受体表达。 方法 20只雄性SD大鼠随机分为LPS组和对照组，LPS组腹腔注射生理盐水，连续处理 3 d后腹腔注射LPS 10 mg/kg，建立内毒素心肌损伤模型。对照组与LPS组腹腔注射等量生理盐水。腹腔注射6 h后于鼠尾部放血测定心肌损伤标志物，断颈活杀取出心脏组织测定EPO 及EPO受体浓度。 结果 LPS组血清心肌损伤标志物（cTnⅠ、CK、CK-MB）水平均显著高于对照组（t = 6.751、5.346、3.432，P < 0.05）。LPS组心脏组织EPO及EPO受体水平均显著高于对照组（t = 2.587、4.306，P < 0.05）。 结论 内毒素诱导大鼠心肌损伤时存在EPO及EPO受体高表达，为外原性EPO在脓毒症的心脏保护中的应用提供了可行性。

[关键词] 内毒素；心肌损伤；促红细胞生成素；促红细胞生成素受体；动物实验

[中图分类号] R363.1+4 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）18-0008-03

脓毒症是临床常见危重病之一，脓毒症已成为世界上ICU患者死亡的主要原因，脓毒症休克患者死亡率高达46.5%[1]。严重脓毒症时心肌抑制的发生率高达 80%，发生心肌损伤达 40%，严重影响患者的预后[2]。细菌产生的内毒素释放入血是脓毒症发生的关键，内毒素可诱导机体出现全身炎症反应综合征从而造成多脏器损伤，特别是引起心肌抑制和心肌损伤，而目前对于脓毒症心肌抑制和心肌损伤尚无有效的治疗方法。促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）是一种糖蛋白造血细胞生长因子，主要由人体中的肾小管周围毛细血管床的间质细胞产生，EPO与促红细胞生成素受体（EPOR）结合调控红系干细胞增殖、分化、成熟，促进网织红细胞释放入血的生物学作用。近几年的研究发现[3]，在发生贫血、缺氧、急性损伤等情况下则能够对 EPO 及其受体的产生起到负反馈调节作用。因此，本课题组于2009年11月～2010年1月通过内毒素诱导大鼠心肌损伤，并采用ELISA法测定心脏组织中EPO及EPOR浓度，以探讨其可能的保护机制。

1材料与方法

1.1药品与试剂

脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS， L2880）、3-去氮腺苷（3-deazaadenosine）、EPO（CSB-E04539 m）及EPO受体（CSB-E0732l m）均为 Sigma公司产品，ELISA试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司。其他试剂均为国产分析纯，水为去离子水。

1.2 实验动物

健康雄性SD大鼠20只，（体重300～320 g，SPF级，华中科技大学同济医学院实验动物中心提供），按清洁级大鼠的要求标准饲养。20只大鼠随机分为脂多糖（LPS）组和对照组各10只。LPS组腹腔注射生理盐水，连续处理 3 d后腹腔注射LPS 10 mg/kg，建立内毒素心肌损伤模型[4]。对照组与LPS组腹腔注射等量生理盐水。

1.3观察指标

①心肌损伤标志物测定：腹腔注射6 h后于鼠尾部放血约0.5 mL/只，低温3000转/min离心15 min分取血清，置-20℃冰箱保存备用待测心肌损伤标志物，包括：心肌肌钙蛋白I（cTnⅠ）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）含量，采用ELISA检测心肌损伤标志物的浓度，检测方法严格按照试剂盒说明书进行。②EPO及EPOR浓度的测定：腹腔注射6 h后鼠尾部放血后立即断颈活杀取出心脏组织于-20℃保存，然后取心肌组织标本在冰冻条件下研磨，制备心肌组织匀浆液，采用ELISA检测EPO及EPOR浓度，检测方法严格按照试剂盒说明书进行，反应终止后用酶标仪在450 nm测定A值，先测得样本的A值，根据标准品的浓度及A值计算出EPO及EPOR的相对浓度。

1.4 统计学处理

计量资料用均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS 13.0数据分析软件进行数据分析，各组间EPO及EPOR和心肌损伤标志物（cTnⅠ、CK、CK-MB）比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS组和对照组大鼠心肌损伤标志物水平检测结果比较

大鼠在腹腔注药6 h后测定血清心肌损伤标志物水平，结果显示，LPS组大鼠血清心肌损伤标志物（cTnⅠ、CK、CK-MB）水平均显著高于对照组（t =6.751、5.346、3.432，P < 0.01）。见表1。

3讨论

目前，我国脓毒症患者的死亡率居高不下，约为20%～40%，其中50%的脓毒症患者出现心肌受损[5]，防治内毒素性心肌损伤对降低脓毒症患者的死亡率具有十分重要的意义。LPS是由O-抗原、核心多糖和类脂A三部分构成的革兰阴性细菌外表层的一种生物大分子，其中只有LPS分子的类脂A基团具有内毒素活性，细菌类脂A基团一旦侵入人体内可以诱发多种疾病[6]。感染性休克、败血症、多器官功能性衰竭等临床常见的革兰阴性菌所致的疾病均与类脂A密切相关[7]。国外的研究报道[8]，内毒素可以激发多细胞因子参与机体反应，并诱导心肌细胞凋亡，这可能是导致心肌损伤的重要机制之一。cTnⅠ、CK、CK-MB是反应心肌细胞损伤较为敏感的指标。当心肌细胞因缺血、缺氧等因素发生变性坏死，cTnI外漏并通过受损的细胞膜弥散进入细胞间质，随之进入血管引起血清cTnI的升高[9]。CK-MB是一种细胞内酶，当心肌缺血或者再灌注损伤时，细胞膜通透性升高导致细胞内的CK、CK-MB大量入血[10]。CK和CK-MB特异性地反映心肌细胞受损程度，血清中CK和CK-MB越高，则表明心肌受损越严重。本研究在腹注LPS后，LPS组大鼠血清cTnⅠ、CK 、CK-MB水平显著高于对照组，提示LPS能引起心脏组织功能的病理学改变，同时也提示本研究建立内毒素心肌损伤模型是成功的。

人类EPO基因由 166 个氨基酸残基组成，定位于 7 号染色体长臂 22 区（7q22），体内EPO主要由低氧诱导产生，肾脏分泌入循环。EPO的作用是维持红细胞造血前体细胞的存活并促进其分裂，诱导晚期红系祖细胞生长成为成熟的红细胞[11]。EPO促进红细胞生成的生物学效应主要是通过位于骨髓红系祖细胞表面的特异性 EPO 受体来完成的，EPO及EPOR结合发挥生物活性，激活多种信号转导途径发挥抗凋亡作用[12]。据研究报道[13]，EPO及EPOR的高表达可能与多种恶性肿瘤的发生和发展、新生血管生成有着密切的关系；此外，EPO及EPOR信号途径在生理及病理的促进心、脑损伤修复等多方面起重要作用[14]。近年来，EPO 参与胚胎的正常发育、促进血管生成、组织保护作用、抑制炎症反应、抗氧化作用等多种非造血生物作用成为研究的热点。但目前尚无证据证明EPO及EPOR在心肌损伤是否也存在其表达水平上调尚不清楚，有内毒素性心肌损伤的发病机制还存有争议，因此，本研究通过动物实验的方式来研究内毒素诱导的心肌损伤时EPO及EPOR的表达水平有着非常重要的现实意义。

研究结果显示，在腹注LPS后，LPS组大鼠心肌细胞EPO及EPOR浓度明显高于对照组，表明内毒素诱导大鼠心肌损伤时存在EPO及EPOR高表达，提示体内感染可能是 EPO 及其受体生成的主要刺激因素，分析其原因可能是急性感染导致心肌细胞受损，EPO及EPOR浓度速度上升，使EPO及EPOR调控系统失活，从而使EPO对心脏的保护作用减弱，这为外源性EPO在脓毒症的心脏保护中的应用提供了可行性。

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（收稿日期：2013-04-11）