半枝莲总黄酮通过PI3K/AKT/mTOR通路诱导肿瘤细胞自噬的体内实验研究

[摘要] 該研究拟从体内角度研究半枝莲总黄酮（TFSB）的抗肿瘤作用，并探讨TFSB对肿瘤细胞自噬的影响及其对PI3K/AKT/mTOR通路的调控作用，为TFSB的抗肿瘤作用提供实验依据。实验以黑色素瘤荷瘤小鼠模型为研究对象，分为空白对照组、雷帕霉素组（Rap，1.5 mg·kg-1）、TFSB高、中、低剂量组（200，100，50 mg·kg-1），每天给药1次，连续用药11 d，通过测量肿瘤的体积及抑瘤率，来观察TFSB对黑色素瘤生长的抑制效果；通过TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况，来进一步验证TFSB的抗肿瘤活性；通过Western blot法检测LC3Ⅰ，LC3Ⅱ的蛋白表达，计算LC3Ⅱ对LC3Ⅰ的相对表达量，探讨TFSB对肿瘤细胞自噬的诱导作用；通过检测PI3K/AKT/mTOR通路标志蛋白的磷酸化水平，研究TFSB诱导细胞自噬的分子机制。结果表明，TFSB可有效抑制荷瘤小鼠体内黑色素瘤的生长，减小肿瘤体积、提高抑瘤率，并且可以显著增加肿瘤细胞凋亡指数，增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，抑制pPI3K，pAKT及pmTOR的蛋白表达水平，与对照组比较有显著性差异（P<0.05，P<0.01或P<0.001）。由此可见，半枝莲总黄酮具有抑制体内黑色素瘤生长的作用，其机制可能与通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路，诱导肿瘤细胞自噬及凋亡有关。

[关键词] 半枝莲总黄酮； PI3K/AKT/mTOR通路； 自噬； 细胞凋亡

Effect of total flavonoids in Scutellaria barbata in mediating

autophagy in tumor cells via PI3K/AKT/mTOR pathway

CHEN Ming， WANG Jutao*， WU Zhenni， HU Manyan， GAO Huawu

（Department of Pharmacology， Anhui University of Traditional Chinese Medicine， Hefei 230038， China）

[Abstract] To investigate the effect of the total flavonoids in Scutellaria barbata（TFSB） against autophagy in tumor cells in vivo， and further determine whether the mechanism is correlated with the PI3K/AKT/mTOR pathway， which lead to autophagyinduced tumor cell death. Melanomabearing mice were prepared and divided into control group， rapamycin group （Rap 1.5 mg·kg-1）， and high， middle and lowdose TFSB （200， 100， 50 mg·kg-1） groups. The groups were given drugs once a day for successively 11 days. The inhibitory effect of TFSB on the growth of melanoma was determined by measuring tumor volume and tumor inhibition rate. TUNEL method was used to detect the apoptosis of tumor cells to further verify the antitumor activity of TFSB. The protein expressions of LC3Ⅰ and LC3Ⅱ were detected by Western blot， and the relative expression of LC3Ⅱ was calculated based on LC3Ⅱ/LC3Ⅰ. In addition， the effect of TFSB on autophagy of tumor cells， the underlying molecular mechanism of TFSB in inducing autophagy and PI3K/AKT/mTOR pathway marker protein phosphorylation were also studied. According to the results， TFSB effectively inhibited melanoma growth in mice， reduced tumor volume， increased the tumor inhibition rate， and significantly increased tumor cell apoptosis index and the ratio of LC3Ⅱ/LC3I （P<0.05， P<0.01 or P<0.001）. The protein expressions of pPI3K， pAKT and pmTOR were also suppressed dramatically compared with those in control group （P<0.05， P<0.01 or P<0.001）. In conclusion， the total flavonoids in S. barbata could inhibit the growth of melanoma in vivo by inducing autophagy and apoptosis of tumor cells， which may be correlated with suppression of PI3K/AKT/mTOR pathway.

[Key words] total flavonoids in Scutellaria barbata； PI3K/AKT/mTOR pathway； autophagy； apoptosis

半枝莲是一种唇形科黄芩属植物的干燥全草，性平、味辛微苦、无毒，古籍记载，具有清热解毒、散瘀活血、解痉祛痰、利尿消肿、抗癌等功效。现代医学研究也表明其具有抗病原微生物、抗肿瘤、抗自由基等多种药理学活性，单方或复方常用于胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤的治疗。关于半枝莲对于肿瘤细胞自噬的影响，仅在2010年发现其活性成分脱镁叶绿酸a可通过激活线粒体介导的细胞凋亡和ERK介导的细胞自噬来发挥抗肿瘤作用[1]。但半枝莲黄酮类化合物对肿瘤细胞自噬的影响，已公开报道的文献较少。因此，本研究拟从体内角度研究半枝莲总黄酮对肿瘤细胞自噬的影响，并观察其对PI3K/AKT/mTOR通路的调控作用，研究其诱导肿瘤细胞发生自噬性死亡的分子机制，为中药抗肿瘤的作用机制和理论创新可能提供新的思路，具有一定的理论价值与实际意义。

1 材料

1.1 药品与试剂 半枝莲总黄酮（the total flavonoids in Scutellaria barbata，TFSB）提取方法：取半枝莲药材10 kg，粉碎，加12倍量80%乙醇回流提取3次，每次1.5 h，滤过，滤液合并，减压浓缩，使每毫升提取液相当于药材2 g，通过聚酰胺柱色谱分离，依次用水、20%乙醇、70%乙醇洗脱，70%乙醇洗脱液浓缩、干燥，得TFSB（浅黄色精细粉末）0.512 kg，得率5.12%，经紫外分光光度法测定，总黄酮含量达75.6%，4 ℃保存备用，经安徽中医药大学王举涛副教授鉴定。临用时，用生理盐水配置成2%，1%及0.5%（分别相当于原药材含量为391，195，97.5 g·L-1）浓度的混悬液备用。

阳性对照药（mTOR抑制剂）为雷帕霉素（rapamycin，Rap），购于北京索莱宝科技有限公司，批号104C0316。药液的配制：将雷帕霉素先用无水乙醇溶解，配成200 mg·L-1，再用生理盐水稀释成150 mg·L-1，置于-20 ℃冰箱中保存、备用。

Tunel试剂盒（10279600）购于Roche公司；DAB显色剂（K136821F）、betaActin（16AV0210）均购于北京中杉金桥生物技术有限公司；预染蛋白Marker（00275697）、ECL超敏发光试剂盒（QE218149）均购于Thermo公司；过硫酸铵（A6761）、甲醇（20160315）、30%丙烯酰胺（ST003）均购于Sigma公司；LC3多克隆抗体（GR1377245）购于Abcam公司；pAKT多克隆抗体（19）购于CST公司；pmTOR多克隆抗体（CN22161）、pPI3K多克隆抗体（CA36131）均购于Bioworld公司。

1.2 仪器 JJ12J脱水机（武汉俊杰电子有限公司）；JBP5包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；RM2016切片机（上海徕卡仪器有限公司）；AF10自动制冰机（意大利SCOTSMAN）；EPS 300电泳仪（上海天能科技有限公司）；LX 300微量离心机（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；TS1000水平摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；JEdA801D形态学分析系统（江苏省捷达科技）；凝胶图像分析管理系统（北京科创锐新生物凝胶成像系统的分析系统）。

1.3 动物 8周龄C57BL/6J小黑鼠，雌雄各半，体重18～22 g，由上海斯莱克动物中心提供，实验动物合格证号SCXK（沪）2012002；鼠料由安徽长临河医药科技有限公司提供，合格证号SCXK（皖）2007001；饮水：实验室自制蒸馏水，高温高压灭菌后使用，实验动物自由进食、饮水，实验室温度控制在20～25 ℃，湿度55%～65%。

2 方法

2.1 黑色素瘤细胞的培养 取B16F1黑色素瘤细胞株，用含10%胎牛血清的DMEM培养液，在37 ℃，5%CO2条件下培养，收集对数生长期的细胞，离心、用PBS洗涤、重悬、细胞计数。

2.2 黑色素瘤荷瘤小鼠模型的建立[23] 取C57BL/6小鼠60只，于左侧腋下皮下按2×106个细胞/瘤的剂量注射上述B16F1黑色素瘤细胞悬浮液，并于接种后的第5天，用游标卡尺测量肿瘤的直径，筛选出肿瘤直径大于2 mm的小鼠50只，进行分组、给药。

2.3 动物的分组及给药 取上述荷瘤小鼠50只，按照肿瘤体积和小鼠体重、性别等因素随机均分为5组：空白对照组、阳性对照组（Rap，1.5 mg·kg-1）、半枝莲总黄酮（TFSB）高（200 mg·kg-1）、中（100 mg·kg-1）、低（50 mg·kg-1）剂量组[4]（分别相当于原药材剂量为3.91，1.95，0.975 g·kg-1）。当肿瘤体积达到要求后，开始给药：阳性对照组腹腔注射150 mg·L-1雷帕霉素10 mL·kg-1体重，半枝莲总黄酮各剂量组分别灌胃2%，1%，0.5%的溶液10 mL·kg-1体重，空白对照组灌胃等容量的生理盐水。每天给药1次，连续11 d[根据美国Institutional Animal Care And Use Committee（IACUC）颁布的Guidelines For Tumor Induction In Mice And Rats （Updated MAY 2013）可知，荷瘤小鼠肿瘤直径不得超过20 mm，此时对照组肿瘤体积已接近20 mm，且增长速度很快，故须及时处理动物、终止实验]。

2.4 半枝莲总黄酮的抑瘤效果观察 用药期间，每天观察肿瘤的生长情况，分別间日称取小鼠的体重，并用游标卡尺测量各组小鼠肿瘤的长径和短径，计算肿瘤体积，根据小鼠体重和肿瘤体积，绘制各组小鼠体重的生长曲线及肿瘤生长曲线。肿瘤体积[3]=长径×短径2/2。末次药后24 h，颈椎脱臼处死小鼠。剥取各组小鼠完整黑色素瘤组织、称取瘤重，并计算抑瘤率。抑瘤率[3]=（对照组瘤重-药物组瘤重）/对照组瘤重×100%。

2.5 TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡情况 取一部分肿瘤组织，进行冷冻切片，TUNEL分析，观察肿瘤细胞凋亡情况，方法如下：组织经石蜡切片脱蜡至水、用蛋白酶K修复、破膜处理后，加试剂：取试剂1 TdT 5 μL和试剂2 dUTP 45 μL混合，覆盖组织，37 ℃水浴60 min，然后将切片放入用甲醇配制的3% H2O2溶液中，室温避光孵育20 min，以阻断内源性过氧化物酶，再加试剂3 converterPOD覆盖组织，37 ℃水浴锅孵育30 min；DAB显色：用新鲜配制的DAB显色液覆盖组织，于显微镜下控制显色时间，阳性凋亡细胞的细胞核呈棕黄色；复染细胞核：用Harris苏木素复染细胞核3 min左右，最后用乙醇、二甲苯等试剂将切片脱水，用中性树胶封片。切片经JEdA801D形态学分析系统观察肿瘤组织细胞凋亡情况，每张切片随机选取5个视野于400高倍镜下观察凋亡细胞数、并计算细胞凋亡指数（apoptosis index，AI）[3]=（对照组瘤重-药物组瘤重）/对照组瘤重×100%。

2.6 Western blot法检测LC3Ⅰ，LC3Ⅱ及pPI3K，pAKT及pmTOR的蛋白表达 剪取100 mg肿瘤组织，用1 mL RIPA细胞裂解液进行裂解，提取组织总蛋白，然后经SDSPAGE凝胶电泳、转膜、封闭。一抗孵育：LC3抗体按照1∶2 000稀释，pPI3K抗体按照1∶500稀释，pAKT抗体按照1∶2 000稀释，pmTOR抗体按照1∶500稀释，4 ℃缓慢摇动孵育过夜，加入TBST洗涤3次，每次洗涤10 min。二抗孵育：参考二抗的说明书，按照1∶1万比例稀释HRP标记的二抗；最后使用ECL发光试剂盒进行蛋白检测，凝胶成像系统观察结果，采用北京科创锐新生物凝胶成像系统的分析系统进行分析。

2.7 数据统计 试验数据采用SPSS 13.0软件，结果以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，2组间采用t检验，以P<0.05为有统计学意义。

3 结果

3.1 半枝莲总黄酮对荷瘤小鼠体重及一般状态的影响 对照组小鼠随着肿瘤的快速生长，精神状态不佳，进食、饮水量及活动量明显减少，但是随着肿瘤的生长，荷瘤小鼠体重却迅速增加；雷帕霉素组小鼠精神状态较好，进食、饮水量及活动量明显增多，肿瘤体积较小，故体重低于模型组，在用药第7，9，11天，与对照组有显著性差异（P<0.05，P<0.01或P<0.001）；半枝莲总黄酮各剂量组小鼠精神状态良好，进食、饮水量、活动量相对于对照组有所增加，在荷瘤状态下，体重低于对照组，其中TFSB高剂量组（200 mg·kg-1）在用药第9，11天与对照组比较有显著性差异（P<0.05或P<0.01），见图1。

3.2 半枝莲总黄酮对荷瘤小鼠黑色素瘤体积的影响 对照组小鼠肿瘤组织生长迅速，肿瘤体积在实验第5日开始迅速增大；雷帕霉素组小鼠肿瘤生长较慢、肿瘤体积较小，于实验第5日，与对照组比较有显著性差异（P<0.05），于实验第7，9，11日，与对照组比较有极显著性差异（P<0.001）；半枝莲总黄酮各剂量组小鼠肿瘤组织生长较对照组比较有所减慢，其中TFSB高剂量组（200 mg·kg-1）在用药第7，9，11日，与对照组比较有显著性差异（P<0.05，P<0.01或P<0.001），TFSB中、低剂量组（100，50 mg·kg-1）分别在用药第9，11日，与对照组比较有显著性差异（P<0.05），见图2。

3.3 半枝莲总黄酮对荷瘤小鼠肿瘤质量及抑瘤率的影响 对照组小鼠肿瘤质量较大，雷帕霉素组小鼠肿瘤质量较轻，与对照组比较有极显著性差异（P<0.001）；半枝莲总黄酮各剂量组小鼠肿瘤均有所减轻，其中TFSB高剂量组（200 mg·kg-1）与对照组比较有极显著性差异（P<0.001），TFSB中、低剂量组（100，50 mg·kg-1）与对照组比较有显著性差异（P<0.05或P<0.01），见表1。

3.4 半枝莲总黄酮对肿瘤组织细胞凋亡的影响 TUNEL法染色检测肿瘤组织细胞凋亡情况，经过JEdA801D形态学分析系统分析可知，阳性凋亡细胞的细胞核被染色呈棕黄色。结果显示，对照组肿瘤细胞凋亡数较少，只见散在零星的凋亡细胞；雷帕霉素组小鼠肿瘤组织内凋亡细胞数较多，镜下可见大量成块状的棕黄色染色的阳性凋亡细胞，其凋亡指数明显升高，与对照组比较有极显著性差异（P<0.001）；TFSB各剂量组（200，100，50 g·kg-1）肿瘤组织内，凋亡细胞数较多，细胞凋亡指数升高，与对照组比较有极显著性差异（P<0.001），这与肿瘤体积及质量分析結果一致，见图3。

3.5 半枝莲总黄酮对肿瘤组织细胞自噬的影响 LC3是检测自噬体最常用的标记，LC3Ⅱ于LC3Ⅰ的相对表达量代表着自噬水平的高低。实验结果显示：雷帕霉素组小鼠LC3Ⅱ/LC3Ⅰ增加，与对照组比较有显著性差异（P<0.05），表明雷帕霉素可诱导肿瘤细胞发生自噬；TFSB各剂量（200，100，50 mg·kg-1）LC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高，与对照组比较有显著性差异（P<0.05），表明半枝莲总黄酮对肿瘤细胞的自噬也有一定的促进作用，见图4。

3.6 半枝莲总黄酮对肿瘤组织PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表达的影响 对照组肿瘤细胞内pPI3K，pAKT，pmTOR蛋白表达较多，表明此通路处于激活状态；雷帕霉素组肿瘤细胞内pPI3K，pAKT，pmTOR蛋白表达明显减少，其相对表达量降低，与对照组比较有极显著性差异（P<0.001）；半枝莲总黄酮各剂量组可显著抑制肿瘤组织内pPI3K，pAKT，pmTOR蛋白的表达，其中TFSB高剂量组（200 mg·kg-1）与对照组比较有极显著性差异（P<0.001），TFSB中、低剂量组（100，50 mg·kg-1）对pPI3K的抑制，与对照组比较有极显著性差异（P<0.001），对pAKT，pmTOR的抑制，与对照组比较有显著性差异（P<0.01），见图5。

4 讨论

半枝莲黄酮类化合物是半枝莲中主要的活性成分，目前已分离鉴定的黄酮类化合物近50种，主要包括芹菜素、野黄芩苷、木犀草素和黄芩苷等，具有保护心脑血管、抗菌消炎、抗病毒、抗肿瘤等多种药理学活性。近年来对半枝莲黄酮类化合物抗肿瘤活性的研究显示：半枝莲总黄酮可通过线粒体途径诱导MHCC97H细胞的凋亡[5]，并且通过降低MMP和TIMP的表达降低MHCC97H细胞的转移能力[6]，通过调节VEGF抑制体内外血管新生[7]。半枝莲中黄酮与顺铂联用可提高人卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性，与顺铂之间产生协同作用[8]。本研究结果显示，半枝莲总黄酮对B16F1黑色素瘤细胞小鼠移植瘤具有显著的抑制作用，使肿瘤体积明显缩小、瘤重减轻、抑瘤率增加，并且可以显著升高肿瘤细胞凋亡指数，与空白对照组比较有显著性差异（P<0.05，P<0.01或P<0.001），与文献报道一致。

自噬是作为溶酶体的主要降解途径之一，使胞内分子和细胞器得以循环利用。研究表明，自噬在腫瘤发生、发展及转移过程中起着既能促进、又能抑制的双重作用。一方面，自噬可以作为一种防御机制，防止胞质内受损细胞器和代谢产物的堆积，保护受损的肿瘤细胞；另一方面，自噬的活性过强，又会使得溶酶体的降解能力不能满足降解自噬体的需要，从而诱导肿瘤细胞发生Ⅱ型程序性细胞死亡，与凋亡共同促进细胞死亡[9]。因此，自噬的发生在肿瘤中起着至关重要的作用，并有可能为肿瘤的防治提供新的思路。

LC3是检测自噬活性最为常用的标志蛋白，LC3Ⅰ为胞质分散型、LC3Ⅱ为膜结合型，当自噬发生时，LC3Ⅰ会转化为LC3Ⅱ，因此LC3Ⅱ于LC3Ⅰ的相对表达量能大致反应自噬水平的高低[10]。在进行SDS凝胶电泳时，LC3Ⅱ（14 kDa）比LC3Ⅰ（16 kDa）移动得更快，因此可以通过Western blot检测LC3Ⅰ，LC3Ⅱ的蛋白表达水平。实验结果显示，半枝莲总黄酮各剂量组可以显著升高LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，与对照组比较有显著性差异（P<0.05）。结果表明半枝莲总黄酮可以诱导肿瘤细胞的自噬，这种作用可能与其抗肿瘤作用相关。

PI3K是一种广泛存在于胞质内的磷脂酰肌醇激酶，能被许多细胞因子受体活化，使得磷脂酰肌醇（PI）在D3 位的磷酸化，促进PIP2转化为PIP3。AKT则可以接受PI3K的信号，通过调控多种转录因子，将信号向下传递到mTOR。mTOR可通过AKT直接或间接磷酸化而被激活，磷酸化的mTOR一方面能够使得细胞周期素上调而加速细胞周期，另一方面，也可以通过清除泛素蛋白从而抑制自噬的发生，由此可见，PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活将对自噬起到抑制作用[11]。本研究通过检测肿瘤组织PI3K/AKT/mTOR通路标志蛋白磷酸化的水平，来考察半枝莲总黄酮诱导细胞自噬的分子机制，结果显示：半枝莲总黄酮各剂量组可显著抑制pPI3K，pAKT，pmTOR的蛋白表达，与对照组比较有极显著性差异（P<0.01或P<0.001）。表明半枝莲总黄酮可以抑制PI3K/AKT/mTOR通路的活化，此作用可能与诱导肿瘤细胞发生自噬具有一定的关系。

综上所述，半枝莲总黄酮可通过诱导肿瘤细胞自噬、促进肿瘤细胞的自噬性死亡从而发挥抗肿瘤作用，其机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR通路的活化有关。但是，本研究也有一些不足之处，例如只使用了自噬促进剂（mTOR抑制剂雷帕霉素）正面论证了自噬和肿瘤发生的关系，为了更好探讨这种关系，最好还要使用自噬抑制剂从反面论证，这部分研究，本课题组将在细胞实验中完成。

[参考文献]

[1] BuiXuan N H， Tang P M， Wong C K，et al. Photoactivated pheophorbidea， an active component of Scutellaria barbata， enhances apoptosis via the suppression of erkmediated autophagy in the estrogen receptornegative human breast adenocarcinoma cells mdamb231[J]. J Ethnopharmacol， 2010，131：95.

[2] Lin Jun， Huang Zhihai， Wu Hao， et al. Inhibition of autophagy enhances the anticanceractivity of silver nanoparticles[J]. Autophagy， 2014，10（11）：2005.

[3] 晋佳路，朱仁书，谢育媛，等.shRNA沉默CDK2基因对B16F1细胞小鼠皮下移植瘤的影响[J].中华肿瘤防治杂志，2016，23（9）：592.

[4] 窦锦明，荆汉卫.半枝莲黄酮类有效部位体内抗肿瘤实验研究[J].药学与临床研究，2015，23（1）：21.

[5] Gao J， Lu W F， Dai Z J， et al. Induction of apoptosis by total flavonoids from Scutellaria barbata D. Don in human hepatocarcinoma MHCC97H cells via the mitochondrial pathway[J]. Tumour Biol， 2014，35（3）：2549.

[6] Dai Z J， Wang B F， Lu W F， et al. Total flavonoids of Scutellaria barbata inhibit invasion of hepatocarcinoma via MMP/TIMP in vitro[J]. Molecules， 2013，18（1）：934.

[7] Dai Z J， Lu W F， Gao J， et al. Antiangiogenic effect of the total flavonoids in Scutellaria barbata D. Don[J]. BMC Complement Alternat Med， 2013，13：150.

[8] Li J， Wang Y， Lei J C， et al. Sensitisation of ovarian cancer cells to cisplatin by flavonoids from Scutellaria barbata[J]. Nat Prod Res， 2014，28（10）：683.

[9] Yang S H， Wang X X， Contino G， et al. Pancreatic cancers require autophagy for tumor growth[J]. Gene Dev， 2011， 25：717.

[10] Daniel J Klionsky， Fabio CAbdalla， Hagai Abeliovich， et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy[J]. Autophagy， 2012， 8（4）：447.

[11] Juhasz G， Hill J H， Yan Y， et al. The class Ⅲ PI（3）K Vps34 promotes autophagy and endocytosis but not TOR signaling in Drosophila[J]. J Cell Biol，2008， 181：655.

[责任编辑 张宁宁]