丹参分支酸变位酶基因的克隆和生物信息学分析

材料

丹参全株分别于2012年11月采自山东莱芜，经黄璐琦研究员鉴定为白花丹参Salvia miltiorrhiza var.miltiorrhiza f.alba，将根、茎和叶分别收集液氮速冻，-80 ℃保存。凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心。

丹参毛状根，由丹参叶片经农杆菌ACCC10060介导产生的不定根^[8-9]，用6，7-V培养基继代暗培养，培养18 d用终浓度分别是30 mmol·L^-1Ag⁺和100 g·L^-1YE联合诱导，分别在诱导后0，4，8，12，24，36 h采收，液氮速冻，-80 ℃保存。

2 方法

2.1 RNA提取与逆转录 采用CTAB法提取丹参原植物根、茎、叶以及对照和处理毛状根总RNA，测定其浓度，选择A_{280/260 1.8～2.0，A260/230 1.8～2.0的总RNA 1 μg，应用Thermo反转录试剂盒，按照操作流程反转录成总cDNA。}

2.2 基因克隆 从丹参毛状根的EST序列分析中发现1条具有完整开放阅读框的CM基因。利用Primer Premier 5软件设计引物Chori-F 5′-CAAATGGAGGCGAAGCTGTTGAG-3′，Chori-R 5′-CAATTTAATCGAGTCTTCTCAAAAGATAC-3′，以丹参总cDNA为模板进行PCR扩增。扩增体系为H₂O 15.4 μL，dNTP 1.6 μL，Ex Taq Buffer 2.0 μL，引物（10 pmol·L^-1）各0.4 μL，Ex Taq（5 U·μL^-1）0.2 μL。扩增条件为95 ℃ 预变性5 min；之后95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min循环30次，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保温。PCR产物中加入1/5 体积的loading buffer，1%琼脂糖凝胶电泳检测，1 000 bp处检测到清晰的目标条带。用胶纯化试剂盒纯化PCR产物，超纯水溶解，与pGEM-T easy载体连接，连接成功后转化DH5α感受态细胞，并涂布在加氨苄青霉素的LB平板上，37 ℃过夜培养。挑取生长良好的单克隆斑点，在加氨苄青霉素的液体LB培养基中扩繁，PCR检测，选择阳性菌株送北京华大基因研究中心测序，得到全长cDNA序列，命名为SmCM1。