不同水稻受体材料对洁净DNA转化效率的影响

摘要：选取不同诱导条件（28 ℃光照、28 ℃黑暗、32 ℃光照、32 ℃黑暗），不同继代次数初代培养、1次继代培养、2次继代培养的愈伤组织，分别作为转化受体材料，研究不同受体材料对洁净DNA转化效率的影响。结果表明，32 ℃光培养诱导的愈伤经过1次继代后作为转化受体材料，得到的转化效率最高，达到9.32%。

关键词：水稻；受体材料；洁净DNA转化；转化效率

中图分类号： Q943；S511.03文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0043-04

收稿日期：2013-09-11

基金项目：浙江经贸职业技术学院科研课题（编号：13QN08）。

作者简介：赵潇（1987—），女，浙江东阳人，硕士研究生，助教，主要从事植物基因工程与分子生物学研究。Tel：（0571）86929740；E-mail：zhaoxiao413@126.com。 传统的遗传转化中，普遍使用完整质粒DNA，非目的基因的质粒载体主干序列经常随着目的基因整合到植物基因组中，并通过形成稳定的次级结构，产生重组热点或导致异常重组，重组产生的基因多拷贝经常导致转基因的低表达甚至基因沉默[1]。基因枪介导的洁净DNA转化技术是直接将外源基因表达框线性DNA导入植物基因组中，所得不含非目的基因的DNA序列，获得安全的转基因植株[2]。基因枪转化的受体材料，所处的生理状态不同，接受外源DNA的能力也不同。一般认为生理活性高的组织或细胞有利于DNA的摄入与整合[3]。选用再生能力强的外植体为转化受体，将有利于转化频率的提高。本研究主要选取不同诱导条件，不同继代次数的愈伤组织，分别作为转化受体材料，将含bar基因的表达框，通过基因枪法导入水稻，以期明确不同水稻受体材料对洁净DNA转化效率的影响。

1材料与方法

1.1材料

供试材料为粳稻日本晴，由中国水稻研究所水稻生物学重点实验室种质创新课题组提供。

1.2基因

含有bar基因的载体质粒为pCB1，pCB1质粒菌保由中国水稻研究所水稻生物学重点实验室种质创新课题组提供。pCB1质粒大小为6.91 kb，结构如图1所示。

1.3培养基

试验中所需的培养基见表1。

1.4水稻愈伤组织诱导

1.4.1不同条件下诱导的愈伤组织挑选籽粒饱满的日本晴成熟种子，粗糙去壳，再挑选胚完整而无裂纹的种子，用70%的乙醇浸泡60 s，再用体积分数30%次氯酸钠溶液（有效氯≥5%）中浸泡15 min，重复该操作1次，用无菌水冲洗 3～5 次，再将种子置于灭菌的垫有滤纸的培养皿中于超净台上吹干，然后接入NB培养基中，在28 ℃光照、28 ℃黑暗、32 ℃ 光照、32 ℃黑暗4种条件下诱导愈伤。待长出可见的芽和愈伤后，将芽掐掉，愈伤朝上继续培养2周，2周之后，将有活力的愈伤移入新NB诱导培养基继代培养15 d，15 d后挑出颜色鲜黄、表面光滑，直径大小约为3 mm左右的愈伤组织颗粒，作为基因枪转化的受体材料。

1.4.2不同继代次数的愈伤组织挑选籽粒饱满的日本晴成熟种子，粗糙去壳，再挑选胚完整而无裂纹的种子，用70%的乙醇浸泡60 s，再用体积分数30%次氯酸钠溶液（有效氯≥5%）中浸泡15 min，重复该操作1次，用无菌水冲洗3～5次，再将种子置于灭菌的垫有滤纸的培养皿中于超净台上吹干，然后接入NB培养基中，在32 ℃光照条件下诱导愈伤。待长出可见的芽和愈伤后，将芽掐掉，愈伤朝上继续培养2

表1水稻组织培养基

培养基成分诱导、继代NB培养基+2 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸 pH值5.8预分化培养基NB基本培养基+5 mg/L 脱落酸+2 mg/L 6-苄氨基嘌呤+0.5 mg/L 萘乙酸 pH值5.8分化培养基NB基本培养基+3 mg/L 6-苄氨基嘌呤+0.5 mg/L 萘乙酸+13g/L山梨醇+50 mg/L羧苄青霉素 pH值5.8生根培养基1/2MS基本培养基+20 g/L蔗糖+2mg/ml 多效唑 pH值5.8MS大量、MS微量、B5有机、Fe-EDTA、30 g/L蔗糖MS基本培养基2 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸、300 mg/L水解酪蛋白、100 mg/L 肌醇3 g/L植物凝胶 pH值5.8高渗培养基NB培养基+2 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸+47 g/L甘露醇+47 g/L山梨醇 pH值5.8

周之后，将愈伤组织等分为3组，从1组中挑出颜色鲜黄、表面光滑、直径大小约为3 mm左右的愈伤组织颗粒，直接作为基因枪转化的受体材料。其余2组移入新的NB诱导培养基进行继代培养。15 d后，将继代培养的愈伤组织分为2组，1组进行第2次继代，另一组中挑取颜色鲜黄、有活力的愈伤组织进行基因枪轰击。2周后，从经过2次继代培养的愈伤组织中挑出合适的愈伤组织颗粒，作为基因枪转化的受体材料。

1.5洁净DNA转化

1.5.1质粒提取pCB1质粒提取方法采用传统的碱裂解法。

1.5.2bar基因表达框回收根据图1，用PstⅠ和BssHⅠ双酶切质粒pCB1产生1.61 kb的bar基因表达框。参照TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0试剂盒回收目的片段。

1.5.3基因枪转化参照Weeks等的方法[4]制备金粉微弹悬液，以1 mg/mL鱼精蛋白作为DNA沉淀剂，轰击时氦气压力为7.59 MPa，轰击距离为5 cm，进行基因枪转化。

1.6愈伤组织分化、幼苗生根及移栽

将经过基因枪轰击的愈伤组织转移至预分化培养基培养10 d后，转移到分化培养基上，每个分化瓶放置1颗愈伤，待长出绿苗至6～7 cm时转移到生根培养基上生根，待根系生长至2～3 cm时，移出培养瓶，用清水冲洗植株及根上黏附的培养基，随后移入转基因苗圃中。

1.7转基因植株的PCR检测

按Edwards等的方法[5]提取待测的叶片总DNA。PCR体系为20 μL，包括1.0 μL 模板，0.2 μL Taq酶，2.0 μL dNTPs（2.5 mmol/L），2.0 μL 10×緩冲液，1 μL引物1（10 μmol/L），1 μL 引物2（10 μmol/L），9.8 μL 双蒸水。bar基因引物P1序列为5′-CAGGAACCGCAGGAGTGGA-3′；引物P2序列为5′-CCAGAAACCCACGTCATGCC-3′；可扩增出大小372 bp的DNA特异性片段。PCR反应参数条件：95 ℃ 预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1.5 min，72 ℃ 延伸 2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物检测采用1%的琼脂糖凝胶，将PCR扩增体系加以体积比为 10 ∶1 的溴酚蓝上样电泳，EB染色后用凝胶成像系统进行扫描成像观察记录图片结果。

1.8转基因植株的抗性鉴定

转基因植株移栽到大田中，存活后用0.32% Basta涂抹叶片，7 d后统计检测植株对除草剂抗性。

1.9数据处理

绿苗分化率=分化绿苗数/轰击愈伤组织数×100%；

阳性植株率=PCR阳性植株数/绿苗数×100%；

转化率=PCR阳性植株株数/轰击愈伤组织数×100%。

每个处理重复3次，结果取平均值，采用t检验比较处理与对照的差异显著性。

2结果与分析

2.1转基因水稻植株的PCR检测结果

利用bar基因序列设计引物对bar基因表达框转化的水稻阳性植株基因组DNA进行PCR扩增检测，以pCB1质粒为阳性对照株及未转化日本晴基因组DNA为阴性对照，进行PCR扩增（图2）。

2.2不同诱导条件培养的愈伤组织对洁净DNA转化效率的影响

4种不同条件下诱导出的愈伤组织作为基因枪转化的受体材料，对洁净DNA转化率的影响结果见表2、图3。从表2中可知，温度和光照条件都能影响水稻植株绿苗分化率、阳性植株率和转化率的改变。以28 ℃黑暗处理为对照组，经t检验分析，32 ℃光照条件下诱导的愈伤最终绿苗分化率极显著提高，转化率显著提高。在温度相同的条件下，光培养的愈伤

表2不同诱导条件下获得的水稻愈伤组织对洁净DNA转化率的影响

诱导条件重复轰击愈伤数

（个）绿苗数

（株）PCR阳性植株数

（株）绿苗分化率

（%）阳性植株率

（%）转化率

（%）32 ℃光照Ⅰ5820534.48258.62Ⅱ5818531.0327.788.62Ⅲ5618632.1433.3310.71x±s57.33±1.1518.67±1.155.33±0.5832.55±0.02**28.70±0.049.32±0.01*32 ℃黑暗Ⅰ5814424.1428.576.90Ⅱ5714324.5621.435.26Ⅲ5915425.4226.676.78x±s58.00±1.0014.33±0.583.67±0.5824.71±0.0125.56±0.046.31±0.0128 ℃光照Ⅰ5815525.8633.338.62Ⅱ6015425.0026.676.67Ⅲ5816427.5925.006.90x±s58.67±1.1515.33±0.584.33±0.5826.15±0.0128.33±0.047.39±0.0128 ℃黑暗Ⅰ5715426.3226.677.02Ⅱ6013321.6723.085.00Ⅲ5814424.1428.576.90x±s58.33±1.5314.00±1.003.67±0.5824.04±0.0226.00±0.036.30±0.01注：**表示差异极显著（P<0.01）；*表示差异显著（P<0.05）。表3同。

组织、长苗后绿苗分化率和阳性植株率都高于暗培养处理。在32 ℃光照诱导下的愈伤，经1次继代培养后，作为基因枪轰击材料，最终所得的绿苗分化率为32.55%，阳性植株率为28.70%，转化率为9.32%，是3个处理组中最高的。表明绿苗分化率的提高在一定程度上促进了阳性植株率的提高，阳性植株率的提高促进了最终转化率的提高。

从图3可知，32 ℃光照培养的条件下，水稻植株的转化率最高达到9.32%，28 ℃光照条件下转化率为7.39%，32 ℃黑暗条件下转化率为6.31%，28 ℃黑暗条件下转化率最小，只有6.30%，在黑暗条件诱导时，最终转化率很接近。表明用洁净DNA技术转化水稻时，32 ℃ 光照条件下诱导的愈伤组织作为转化的受体材料，转化率最高。

2.3不同继代次数的愈伤组织对洁净DNA转化效率的影响

3种不同时期的愈伤组织作为基因枪转化的受体材料，对洁净DNA转化率的影响结果见表3。从表3中可知，不同继代次数的愈伤组织作为受体材料，最终所得的水稻植株绿苗分化率、阳性植株率和转化率都不相同。以初代培养的愈伤组织作为对照组进行t检验，经1次继代培养后，绿苗分化率得到极显著提高，达到32.55%，经2次培养后，绿苗分化率显著降低，仅有21.91%；经1次继代培养后，转化率也得到显著提高。

从表3还可知，1次继代培养的愈伤组织作为转化受体材料，水稻植株的转化率最高，为9.32%，其次是初代培养，为575%，而2次继代培养的愈伤组织作为轰击材料得到的转化率最低，只有3.57%。表明经过1次继代培养的愈伤组织作为基因枪转化的受体材料，进行洁净DNA转化时转化率最高。

2.4植株抗性鉴定

将PCR检测阳性植株移栽至大田，成活之后对阳性植株进行抗除草剂试验，即在水稻植株叶片上涂抹0.32%的 Basta 溶液，7 d后统计成活情况。发现转基因植株的叶片及整株均不受影响，而非转基因植株的叶片变褐枯死（图4）。表明转基因植株具有对Basta 的抗性。表3不同时期愈伤组织对洁净DNA转化的影响

愈伤时期重复轰击愈伤数

（个）绿苗数

（株）PCR阳性植株数

（株）绿苗分化率

（%）阳性植株率

（%）转化率

（%）初代培养Ⅰ6015225.0013.333.33Ⅱ5815425.8626.676.90Ⅲ5714424.5628.577.02x±s58.33±1.5314.67±0.583.33±1.1525.14±0.0122.86±0.085.75±0.021次继代培养Ⅰ5820534.4825.008.62Ⅱ5818531.0327.788.62Ⅲ5618632.1433.3310.71x±s57.33±1.1518.67±1.155.33±0.5832.55±0.02**28.70±0.049.32±0.01*2次继代培养Ⅰ5513323.6423.085.45Ⅱ5712121.058.331.75Ⅲ5712221.0516.673.51x±s56.33±1.1512.33±0.582.00±1.0021.91±0.01*16.03±0.073.57±0.02

3讨论

基因枪转化过程中，通常选用生理活性高、再生能力强的外植体作为转化受体，有利于转化率的提高。本研究中选用成熟胚诱导的愈伤组织作为转化受体材料，转化率比幼胚会相对偏低，愈伤在培养过程中易褐化。针对上述问题，应严格注意成熟胚诱导愈伤过程，尽可能在短期内完成诱导过程，减少愈伤的褐化率。

Toki认为温度控制在32 ℃可以有效提高酶的活性，加快愈伤组织的生长[6]。刘萍等将春小麦在32 ℃条件下诱导，出愈率也普遍提高[7]。本试验结果与前人研究结论一致。选择在32 ℃条件下诱导，可以使水稻愈伤组织生长迅速，可以保证酶活，使其本身处于较高活性状态，间接促进水稻植株转化率的提高。在诱导愈伤时，光照能有效调节细胞的分化状态，促进愈伤诱导，愈伤诱导率明显高于暗培养，光培养能大大缩短诱导愈伤的周期，减少愈伤组织褐化率，间接促进转化率的提高。

本试验结果表明，经过1次继代培养后的愈伤组织作为基因枪转化的受体材料所得转化率最高，胡张华等的研究结果[8]一致。因为在初代培养时期，许多细胞分裂刚处于分裂初期，活力不够旺盛，并不是T-DNA整合摄入的最适宜时期。经过2次继代的愈伤组织，随着培养时间的延长，褐化率明显增加，细胞活力和分裂能力也开始下降，不利于T-DNA的整合摄入。经过1次继代的愈伤组织，生理活性和再生能力都处于最佳状态，细胞分裂旺盛，能够承受基因枪轰击并且易于接受转化。

本试验结果以成熟的粳稻品种为水稻材料，在32 ℃光照条件下诱导愈伤，然后经过1次继代培养的愈伤组织，作为基因枪转化的受体材料，对洁净DNA转化效率最高。

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