百脉根高频再生体系建立和猪瘟病毒E2基因的遗传转化

摘要：在建立百脉根（Lotus corniculatus L .）高频再生体系的基础上，通过农杆菌介导，将猪瘟病毒（CSFV）表面抗原E2基因转化进入百脉根，获得转基因阳性株系5个。并对遗传转化体系中关键性因素进行优化，结果表明，最优化体系为子叶预培养3 d后，用OD600nm为0.5±0.05的菌液侵染30 min，共培养3 d并添加AS（乙酰丁香酮），选择培养基中卡那霉素浓度为50 mg/L，可获得理想的转化效率。为抗猪瘟可食性疫苗的研制奠定基础。

关键词：百脉根（Lotus corniculatus L .）；高频再生；遗传转化

中图分类号：Q78文献标识码：A文章编号：0439-8114（2014）10-2368-05

Establishing Regeneration System of Lotus corniculatus L. with High Frequency and Genetic Transformation of CSFV E2 Gene

JIA Yong-hong，SUN Yan-xiang，ZHANG Jiang-li，FENG Xue，YUAN Xiao-yuan，ZHANG Bing

（College of Life Science，Langfang Normal College，Langfang 065000，Hebei，China）

Abstract： Based on the established regeneration system of Lotus corniculatus L. with high frequency and mediated by Agrobacterium tumefaciens，5 lines of transgenic Lotus corniculatus L. with E2 gene of classical swine fever virus（CSFV） were obtained. Several key factors affecting genetic transferring system were optimized during E2 genetic transformation. The results showed that the optimal system was pre-cultivated cotyledon for 3 days and infected with Agrobacterium at the concentration of OD600nm=0.5±0.05 about 30 min. After co-cultured for 3 days， 100 μmol/L AS was added in culture medium containing 50 mg/L Kanamycin. Under this system， ideal efficiency of genetic transformation was achieved. It will lay a foundation for edible vaccine of resisting swine fever.

Key words： Lotus corniculatus L.；high frequency regeneration；genetic transformation

基金项目：廊坊师范学院自然科学基金项目（LSZY201105）；廊坊师范学院大学生创新创业训练计划项目（201310100007）；廊坊师范学院生命科学学院“本科生参与研究性项目”（SKCYZ201302）

百脉根（Lotus corniculatus L.）是世界上广泛栽培的多年生优良豆科牧草之一，在水土保持和牧场改良等方面也有独特的作用。百脉根细胞全能性强，容易获得高频再生植株，遗传转化率相对较高、转基因植株生长速度快[1，2]，是植物转基因和生物固氮机理等研究的良好材料。近年来植物作为生物外源蛋白的天然生物反应器生产可食性疫苗和植物抗体的研究已取得了可喜的进展，引导着国际疫苗研制开发的新潮流[3-5]，而E2基因作为外源基因研制抗猪瘟转基因疫苗尚属有限[6，7]，本研究以猪瘟病毒表面抗原E2基因为外源基因，以农杆菌介导方法实施百脉根为转基因受体的遗传转化，以期为抗猪瘟转基因可食性疫苗的研制提供参考方案。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料供试百脉根：暖季型，购至上海春茵种业有限公司。含E2外源基因的根癌农杆菌菌株EHA105（pGN-E2），其中pGN载体由南开大学白艳玲老师提供。

1.1.2基本培养基MS培养基：大量元素、微量元素、铁盐、有机成分所用试剂均为国产分析纯，蔗糖浓度均为30 g/L，琼脂均为8 g/L，6-BA 配成1 mg/L贮液。

抗生素类：羧苄青霉素（Car，100 mg/L）、卡那霉素（Kana，50 mg/L），头孢霉素（Cef，300 mg/L、450 mg/L），均由上海生工生物工程技术服务有限公司进口分装试剂配成1 000×贮液-20 ℃保存。

1.2方法

1.2.1无菌苗的获得选取子粒饱满的百脉根种子，采用3种方法处理种子：①自来水冲洗数次，室温浸泡8～12 h，换水2～3次，然后在超净工作台上浸入70%乙醇并振荡3 min，0.1%升汞振荡消毒5 min。②百脉根种子先用清水冲洗数次，然后在超净工作台上浸入70%乙醇并振荡5 min，0.1%升汞振荡消毒8 min。③百脉根种子先用砂纸轻轻打磨，然后清水冲洗数次，在超净工作台上浸入70%乙醇并振荡5 min，0.1%升汞振荡消毒8 min。处理过的种子分别用无菌水冲洗5次以上，控干后接种于MS培养基上，在（25±1） ℃条件下培养5～7 d，即可获得无菌苗。

1.2.2不定芽的再生和分化无菌条件下把6～7 d苗龄无菌苗的子叶横切成两半， 下胚轴切成约0.5 cm长度的小段，同期把2周苗龄的真叶横切成两半，茎段切成约0.5 cm长度， 分别接种到分化培养基（MS+0.1 mg/L 6-BA）上，置于光照培养室中，（25±1） ℃，光/暗周期16 h/8 h，光照度2 000 lx。

1.2.3再生苗生根及移栽从分化培养基中取出超过2 cm高的丛生苗，MS液体培养基中分割成单株，插入无激素MS培养基中诱导生根，待根长达到2 cm以上，先在培养室去掉封瓶膜炼苗4～5 d，然后在温室中适应3 d后小心地取出再生苗，流水小心冲洗根系，培养基彻底洗掉后移入花盆，移栽后的前几天覆以塑料膜保湿。高度不足2 cm的丛生苗分割后，转入新的分化培养基中继代以诱导再生。

1.2.4外植体预培养、侵染和共培养用于侵染的百脉根子叶和下胚轴取自7 d左右的无菌苗，真叶取自12～14 d苗龄的无菌苗，子叶和真叶横切为两半，下胚轴切成0.5 cm长度小段，接种到含0.1 mg/L 6-BA的MS培养基中预培养3～4 d，取出并浸入用MS液体培养基悬浮的工程菌液中，轻摇侵染30 min后，期间用灭菌镊子搅动以使其充分接触菌液，移除菌液后，用无菌纯水和MS液体培养基洗涤外植体各1次，无菌滤纸吸干子叶和下胚轴表面多余液体，接入共培养基 （MS+0.1 mg/L 6-BA） 中，无光照共培养3 d左右。同时对未经预培养的外植体进行同样的侵染和共培养处理。以未经侵染的子叶、下胚轴外植体作对照。

1.2.5侵染后外植体的选择培养及继代共培养3 d后， 至外植体周围形成淡淡的菌圈后，转入选择分化培养基（MS+0.1 mg/L 6-BA +Kana 50mg/L +Cef 300 mg/L +Car 100 mg/L）中进行转化体的筛选培养与再生芽的诱导，组培室培养条件：（25±1） ℃，光/暗周期16 h/8 h，光照度2 000 lx 。待不定芽长成2 cm以上的无根苗，将分化出的无根苗再行剪切成0.5 cm长度茎段和无叶柄叶片，水平接入新的选择分化培养基中继代，对于丛生芽则分割成小块后转入新的选择分化培养基中继续分化，每4周继代1次。并将第三次继代的卡那霉素浓度升至75 mg/L。

1.2.6转化体的PCR鉴定继代得到的再生苗取其鲜嫩叶片3～4片，采取CTAB法提取基因组DNA。以提取的转基因植株（或无根苗）的基因组DNA为模板进行PCR扩增，阳性克隆的质粒DNA为阳性对照，以非转基因百脉根基因组DNA为阴性对照。PCR引物为E2-UP：GCTTCTAGAATGCTAGCCTGCAAGGAAGATTAC；E2-DN：TCAGAGCT CTCAGTCAGTCGCATCCAGGTCAAAC由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。PCR反应体系为：10×PCR Buffer 2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，Taq酶（5 U/μL）0.5 μL，DNA模板1 μL，去离子水补足至20 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30次循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。对PCR检测阳性株系采用北京天根生物公司RNAplant试剂盒提取叶片总RNA，去除基因组DNA后用MMLV反转录酶合成cDNA，进一步进行RT-PCR扩增，经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

2结果与分析

2.1无菌苗制备方法比较

三种方法消毒种子，均可获得生长良好的无菌苗。“1.2.1”中方法③经砂纸打磨处理但未浸泡的种子发芽率最高，可达到80%以上，接种第三天即有大量种子萌发出芽，但萌发时间差异较大，一周后仍有开始萌发的种子；其次是方法②未经砂纸打磨和浸泡的种子，发芽率在73%以上，萌发时间差异与方法③相似；方法①先行浸种但发芽率较低，只有56%，可能由于乙醇和升汞对已经吸涨的种子造成毒性损伤而致，但萌发时间较为整齐，适于批量处理。

2.2外植体的再生和生根

无菌苗的子叶、下胚轴、真叶和茎段作为外植体，其分化情况不同（表1），其中以子叶的不定芽分化频率和再生苗发育情况最为理想，其次为下胚轴。子叶外植体7 d后切口和边缘都出现了绿色芽点，进一步形成不定芽，3周后不定芽高度达到2 cm；下胚轴的断口处有绿色愈伤逐渐膨大，部分可分化出不定芽；真叶和茎段再生速度较慢，尤其茎段分化形成的愈伤组织褐化和玻璃化现象严重，分化频率较低。

分化培养基上继代形成的再生苗密集丛生，分割成单株插入无激素MS培养基中，7 d后切口周围出现新的芽点，同时长出白色幼根，14 d后根长达到2 cm，根诱导率达到100%。经炼苗后，移栽成活率可达78 %，植株生长正常。

2.3百脉根的遗传转化

本研究对预培养和不经预培养的百脉根子叶、下胚轴、真叶进行侵染，发现未经预培养的外植体经农杆菌侵染处理后共培养阶段农杆菌繁殖较快，外植体开始变黄，在选择培养时变灰甚至褐化，最终褐化死亡，成活率仅为4.3%；外植体经预培养后转化效率大大提高，预培养3～4 d的子叶明显增大变厚、下胚轴明显长大增粗，侵染后经共培养再转入选择分化培养基中，7 d后子叶切口和边缘陆续分化出绿色芽点，14 d后不定芽超过0.5 cm，下胚轴则在断口处长出黄绿色愈伤组织并逐渐膨大，也有的直接长出不定芽（图1、图2），子叶、下胚轴平均抗性再生芽诱导率分别达到26%、15%。真叶再生速度慢，大多数外植体逐渐黄化以致褐化死亡，分化频率较低，仅为6%。继代培养无叶柄叶片和茎段均可再分化出芽，叶片仍以直接分化出不定芽为主，茎段则从愈伤组织上形成丛生芽（图3～图5），二者形成的继代丛生苗均可正常生根（图6）。

农杆菌（EHA105）浓度和侵染时间对转化效率影响较大，其中工程菌液的OD600 nm为0.45～0.55时效果最佳，活化后的菌液按1%接种量，约经过7～8 h扩繁即可达到对数生长期。浓度过低（OD600 nm<0.3）转化率偏低，选择培养期间95%的外植体黄化死亡；浓度太高时（OD600 nm>0.8）外植体成活率降低，共培养3 d的外植体周围及表面均有农杆菌覆盖，选择培养基上农杆菌仍然无法抑制，很快褐化死亡。本研究设定侵染时间为30 min，时间太短或太长也都会降低转化效率。共培养时间以3 d为宜，至外植体周围出现薄雾状的菌圈，转入选择培养基后农杆菌能得到有效控制，外植体成活率和分化率较高；共培养超过4 d，农杆菌菌落明显，甚至有些外植体表面被农杆菌覆盖，选择培养时农杆菌不容易控制，造成外植体变黄，继而褐化死亡，转化效率降低。将共培养中农杆菌包围的尚未变黄的外植体用无菌水、含有的Cef 300 mg/L +Car 100 mg/L的MS、MS培养基依次浸洗后转接到选择培养基上，可有近40%的外植体可继续分化，但需要多次浸洗转接才可彻底脱菌。

对照组未经侵染的子叶、下胚轴等外植体，经预培养6 d后转入选择培养基，14 d后仍无芽分化，呈土黄色或黄色，部分外植体切口处出现小块的愈伤组织，生长极缓慢，逐渐白化死亡。

此外，试验中对共培养的培养基中添加乙酰丁香酮（AS）100 μmol/L）与否进行对比，发现添加AS的外植体经选择培养后存活率明显增加，说明添加AS可提高抗性芽的形成。乙酰丁香酮（AS）可诱导农杆菌Vir基因活化[9]，从而促进外源基因的整合，提高转化率。

本研究得到的抗性苗经提取基因组DNA 和RNA，并进行PCR和RT-PCR检测（图7～图9），5个转基因株系得到大约1 000 bp的扩增条带，电泳谱带符合预期，说明外源的E2基因已转化进入百脉根基因组中并得到转录。

3讨论

3.1百脉根高频再生体系外植体的选择

百脉根无菌苗取得的外植体，均可不同程度地分化成苗，再生能力较强，其中以子叶的不定芽分化频率和再生苗发育情况最为理想，与孙艳香等[1]、张振霞等[8]的结果类似。子叶多数可通过器官发生途径直接再生出芽，几乎没有或仅有少量愈伤组织出现，芽较易伸长，每片叶的平均再生芽数较多。不通过愈伤组织的再生途径不但可以避免变异的发生而且可以缩短子叶再生出芽的时间[10，11]，利于转基因操作及抗性芽筛选。下胚轴分化不定芽的频率低于子叶，多数需要经过愈伤组织的形成，再分化出不定芽，芽生长相对于子叶再生的芽较慢。真叶几乎不形成愈伤组织，但不定芽分化频率较低，而且芽生长较为缓慢，苗不够强壮；茎段也可以在愈伤组织上分化出不定芽，但分化率低，分化出不定芽时间长，生长慢，出现明显玻璃化和苗畸形。因此选择子叶作为转基因操作的外植体最为理想，且材料容易取得，易于诱导再生不定芽。

3.2百脉根遗传转化条件优化

本研究通过对预培养和不经预培养的百脉根子叶、下胚轴、真叶进行侵染对比，发现经过预培养的外植体转化效率明显提高，可能是外植体在预培养期间离体组织进入快速分裂期，处于良好的感受状态，易于接受外源DNA，同时分裂细胞可产生小分子量的酚类化合物，促进农杆菌向受伤细胞表面吸附并激活Vir基因[12，13]，进而获得较高的转化效率。而未经预培养的外植体，由于离体组织处于应激过渡阶段，未进入快速分裂期和最佳感受状态，侵染后农杆菌工程菌繁殖较快，外植体细胞分裂受到抑制而相对较慢，转化细胞较少，因而在选择培养时褐化死亡；预培养时间太长则可能导致伤口愈合、细胞壁完全修复，不利于T-DNA的转移和整合，转化效率明显降低。因此，百脉根子叶的预培养时间应控制在3～4 d内。在试验中对于预培养时间过长的外植体采取重新分割的方法，仍然可以取得较好的转化效率。说明未愈合的伤口是遗传转化的重要条件。

农杆菌浓度和侵染时间对转化效率影响较大，浓度或侵染时间不适宜都会降低转化率，可能是浓度偏低或侵染时间太短时，进入外植体的农杆菌数量少而导致转化率偏低，浓度太高或侵染时间太长时，附在外植体表面和进入外植体组织内的工程菌数量大，农杆菌的繁殖得不到抑制，外植体周围及表面均被农杆菌覆盖，外植体细胞分裂受到竞争性抑制，导致成活率降低。共培养时间过长，同样可导致农杆菌过度繁殖而降低外植体成活率[14，15]。适时清除外植体表面过多的农杆菌可降低外植体的死亡率。本研究表明，百脉根遗传转化的农杆菌浓度控制在OD600 nm 0.45～0.55，侵染时间在30 min内可获得较好的转化效率。

3.3抗生素的种类和剂量

本研究在百脉根外植体对卡那霉素、农杆菌EHA105对头孢霉素和羧苄青霉素的敏感试验基础上，确定选择培养基中抗生素的配比为：Kana 50 mg/L+Cef 300 mg/L +Car 100 mg/L，同时试验中对未经侵染的外植体进行选择培养，结果外植体全部白化死亡。这表明选择培养基中适宜浓度的卡那霉素可有效抑制非转化组织的生长和再生，从而筛选出对卡那霉素具有抗性的转化细胞，头孢菌素和羧苄青霉素则起到抑制农杆菌繁殖，进而使外植体组织彻底脱菌。

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