miR—221对结核分枝杆菌感染巨噬细胞后炎性因子表达的影响

[摘要] 目的 探讨microRNA-221（miR-221）对结核分枝杆菌感染巨噬细胞后炎症因子水平的影响。 方法 用qRT-PCR检测结核分枝杆菌感染后巨噬细胞中miR-221的表达；用miR-221模拟物和miR-221抑制物转染结核分枝杆菌感染的巨噬细胞，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法和Griess法分别检测炎症因子表达和NO分泌；双荧光素酶报告基因、qRT-PCR和Western blot法检测miR-221和Rho相关蛋白激酶1（ROCK1）的靶向关系。 结果 miR-221在结核分枝杆菌感染的巨噬细胞中低表达；miR-221模拟物上调巨噬细胞miR-221的表达水平，抑制巨噬细胞肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6和NO的分泌；miR-221抑制物下调巨噬细胞miR-221的表达水平，促进巨噬细胞TNF-α、IL-1β、IL-6和NO的分泌；miR-221可作用于ROCK1的3′UTR，并抑制其表达（P < 0.05）。 结论 miR-221通过靶向抑制ROCK1的表达抑制结核分枝杆菌感染巨噬细胞后的炎症因子的表达。

[关键词] 结核分枝杆菌；单核巨噬细胞；MicroRNA-221；Rho相关蛋白激酶1；炎症因子

[中图分类号] R521 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）08（c）-0014-05

[Abstract] Objective To explore the effects of miR-221 on the inflammatory factor secretion from macrophages after Mycobacterium tuberculosis infection. Methods The expression of miR-221 in macrophages after Mycobacterium tuberculosis infection was detected by real-time quantitative PCR （qRT-PCR）. Macrophages were transiently transfected with miR-221 mimic or miR-221 inhibitor. The expression of macrophage inflammatory factor and secretion of NO were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） and Griess method， respectively. The relationship of miR-221 and Rho-associated， coiled-coil containing protein kinase 1 （ROCK1） was analyzed by dual-luciferase reporter gene assay， qRT-PCR and Western blot. Results Down-regulated miR-221 was observed in macrophages infected with Mycobacterium tuberculosis. The expression of miR-221 in macrophages was up-regulated by miR-221 mimics， but down-regulated by miR-221 inhibitors. The secretions of TNF-α， IL-1β， IL-6 and NO were significantly accelerated in macrophages infected with Mycobacterium tuberculosis， and increased in miR-221 up-regulated macrophages， but suppressed in miR-221 down-regulated macrophages. miR-221 directly binds to the 3′UTR of ROCK1， and negatively regulated its expression. Conclusion miR-221 can regulate the ROCK1 expression and inhibit the secration of inflammatory factors expression in macrophages after Mycobacterium tuberculosis infection.

[Key words] Mycobacterium tuberculosis； Monocyte-derived macrophages； MicroRNA-221； Rho-associated， coiled-coil containing protein kinase 1； Inflammatory factors

肺結核是由结核分枝杆菌感染引发的一种慢性传染性疾病[1]。巨噬细胞在肺结核的发病机制中发挥重要作用[2]。结核分枝杆菌感染人体后，主要被巨噬细胞吞噬，随后巨噬细胞产生和分泌肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β和IL-6等多种细胞因子介导机体的杀菌过程[3]。同时，感染细菌的巨噬细胞内一氧化氮合酶（NOS）的活性随时间的延长升高，导致NOS的催化底物NO的的含量增加，此NO会作为强抗炎氧化剂促进杀灭结核分枝杆菌[3]。因此，炎症因子和NO在肺结核的疾病进程中起重要作用。研究发现miR-221能够通过调节各类炎症因子的表达，在免疫反应过程中发挥重要作用[4-5]。据报道，microRNA-221（miR-221）在结核分枝杆菌感染的肺结核患者中表达降低[6-7]。本研究探讨miR-221在巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染的免疫调节中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

结核分枝杆菌强毒株H37Rv（美国ATCC公司）；HEK293细胞（中国科学院上海细胞库）；miR-221模拟物、抑制物（上海吉玛生物制药技术有限公司）；酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海BlueGene公司）。

1.2 细菌制备

细菌初次传代后培养6～7 d[8]，收集菌液，制成单细菌悬液，再调整浓度至4×107个/mL。

1.3 细胞分离和培养

巨噬细胞分离自健康人的外周血（陕西省汉中市中心医院检验科采集），方法如文献[9]所述。取健康人的静脉血，将血液离心得到单核细胞。洗涤去除血小板后，用含20%人血清白蛋白的RPMI 1640培养基于37℃、5%CO2的培养箱中培养，2～3 d换1次液，7～10 d后即可自然分化成巨噬细胞。

1.4 细胞转染

取对数生长期的巨噬细胞，用LipofectamineTM 2000转染miR-221模拟物、miR-221抑制物以及相应的阴性对照，培养48 h。

1.5 细菌感染巨噬细胞

巨噬细胞与结核分枝杆菌的比例为1∶5，在含0.4%人血清白蛋白RPMI 1640培养基中混合[6]，37℃孵育24、48、72 h后收集细胞。

1.6 ELISA检测

收集细胞培养上清，用ELISA法分别检测IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。实验重复3次。

1.7 Griess法

收集培养上清液，加Griess试剂反应10 min，检测吸光度（OD550 nm）值，计算NO浓度，实验重复3次。

1.8 双荧光素酶报告基因

双荧光素酶报告基因载体的构建：对ROCK1的3′UTR序列与miR-221相互作用进行预测，且对相互作用的靶点进行序列突变（Mut ROCK1），并将突变序列插入到pGL3荧光素酶报告载体的XbaI/FseI位点。PCR扩增ROCK1包含miR-221假定结合位点的3"UTR cDNA，并将扩增出的序列连接于pGL3双荧光素酶报告基因载体上。将HEK293细胞种于24孔板中，将pGL3-ROCK1 3′-UTR与miR-221模拟物共转染于细胞中。转染48 h后收集细胞，在酶标仪上检测荧光素酶活性，实验重复3次。

1.9 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

用TRIzol提取细胞总RNA。miR-221的检测：100 ng总RNA用逆转录试剂盒逆转录得到cDNA，以U6为内参基因，用qRT-PCR试剂盒检测miR-221表达水平。ROCK1的检测：2 μg RNA用M-MLV逆转录酶合成cDNA，以β-actin为内参基因，qRT-PCR试剂盒检测ROCK1表达水平。用2-ΔΔCt计算mRNA表达量。

1.10 Western blot

细胞经RIPA裂解后，用BCA法测蛋白浓度，等量蛋白样本上样，经SDS-PAGE分离后转至PVDF膜，50 g/L脱脂奶粉封闭2 h后，加兔抗人ROCK1抗体，4℃孵育过夜；用TBST洗膜后，加入HRP标记的山羊抗兔IgG，室温孵育1 h，洗膜后，ECL化学发光显色，实验重复3次。

1.11 统计学方法

数据采用SPSS 22.0软件进行分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验或方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结核分枝杆菌感染降低巨噬细胞miR-221的表达

在结核分枝杆菌感染巨噬细胞不同时间后，miR-221的表达水平均显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图1。

2.2 miR-221模拟物和miR-221抑制物改变巨噬细胞miR-221的表达水平

将miR-221模拟物或miR-221抑制物转染入巨噬细胞中，结果发现，miR-221模拟物组的miR-211表达高于模拟物对照组，同时miR-221抑制物组的miR-211表达低于抑制物对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2。

2.3 miR-221抑制结核分枝杆菌感染后巨噬细胞炎症因子的分泌

感染组、模拟物对照组、抑制物对照组巨噬细胞TNF-α、IL-1、IL-6的表达高于对照组，miR-221模拟物组的TNF-α、IL-1、IL-6表达低于模拟物对照组，miR-221抑制物组的TNF-α、IL-1、IL-6表达高于抑制物对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图3。

2.4 miR-221抑制结核分枝杆菌感染后巨噬细胞NO的释放

感染组、模拟物对照组、抑制物对照组的NO释放量高于对照组，miR-221模拟物组的NO量高于模拟物对照组，miR-221抑制物组的NO量低于抑制物對照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图4。

2.5 miR-221对ROCK1的调控作用

用靶基因预测软件（TargetScan）发现，在多种炎症疾病中起重要作用的分子ROCK1是miR-221的一个靶基因（图5A）。双荧光素酶报告结果显示，过表达miR-221，靶基因ROCK1 3′UTR区活性明显受到抑制（P < 0.05，图5B）。检测miR-221对结核分枝杆菌感染细胞中ROCK1表达的影响，感染组、模拟物对照组、抑制物对照组中ROCK1 mRNA和蛋白的表达高于对照组，miR-221模拟物组中ROCK1 mRNA和蛋白的表达低于模拟物对照组，miR-221抑制物组中ROCK1 mRNA和蛋白的表达高于抑制物对照组，差异有统计学意义（P < 0.05，图5C～D）。

3 討论

巨噬细胞是结核分枝杆菌感染的主要靶细胞和宿主细胞，该细胞在结核分枝杆菌引起的免疫反应中起重要作用[10]。机体感染结核杆菌后，巨噬细胞被激活，高表达NOS和L-精氨酸，并在四氢生物碟呤的存在下，催化产生非特异性的杀菌物质NO，参与抗感染早期过程[11]。同时活化的巨噬细胞促进TNF-α、IL-1、IL-6等细胞因子大量释放，活化炎症细胞，增强机体对结核分枝杆菌的杀伤功能。本实验中巨噬细胞用结核分枝杆菌感染后TNF-α、IL-1、IL-6释放显著增加。

研究发现，多种miRNA在肺结核患者血液中异常表达[12]。如miR-21[13]、miR-146a[14]和miR-144[2]等。据报道miR-221可转录调节炎症相关因子的表达[4]，可通过靶向调节脂联素受体1调节血管内皮细胞的炎性反应[5]。Ni等[6]发现miR-221在结核分枝杆菌感染的巨噬细胞中表达降低。本研究发现，结核分枝杆菌感染巨噬细胞后，miR-221表达显著降低，与现有文献报道[6]一致。此外，通过在巨噬细胞中转染miR-221模拟物及抑制物，提示miR-221模拟物降低炎性因子和NO分泌，miR-221抑制物促进炎性因子和NO分泌，提示巨噬细胞可能通过调节miR-221的表达，抑制结核分枝杆菌的免疫清除。

ROCK是炎症疾病中的关键调节分子，在脊髓损伤[15]、急性肺损伤[16]和心血管疾病[17-18]等多种炎症疾病中起重要作用。ROCK以ROCK1和ROCK2两种异构体形式存在。ROCK1对炎症细胞的黏附起重要的调节作用[19]，且有实验证明ROCK1可激活巨噬细胞介导的炎性反应[20]。本研究用生物信息学的方法预测出miR-221与ROCK1存在良好的碱基互补关系，并通过双荧光素酶报告基因、qRT-PCR和Western blot提示miR-221可靶向调控ROCK1的表达。

综上所述，miR-221在结核分枝杆菌感染的巨噬细胞中表达降低，miR-221负性调节结核分枝杆菌诱发的巨噬细胞免疫应答，并可靶向抑制ROCK1 mRNA和蛋白的表达，为研究巨噬细胞在机体内的免疫机制提供理论依据。

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