Lenti—Toll样受体4—siRNA的构建及对大鼠肺泡巨噬细胞NR8383的影响
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1.1 材料与试剂
聚合酶链反应（PCR）反应试剂，Primer（R&F）合成、dsDNA oligo、293T细胞株、大肠埃希菌菌株DH5α、病毒载体均由上海吉凯基因化学技术有限公司提供；Taq酶、SYBR Master Mixture购于TaKaRa；Age Ⅰ、EcoR Ⅰ、T4 DNA ligase、T4 DNA ligase buffer来自于NEB；QIAGEN Plasmid大抽Kit来自QIAGEN；Rnase Inhibitor、dNTP、M-MLV逆转录酶购于Promega；Lipofectamine 2000、Trizol购自Invitrogen；ECL-PLUS/Kit购于Amersham公司；positive clone测序由上海美季生物技术有限公司完成；胎牛血清、DMEM购自Gibco公司；Opti-MEM购自Invitrogen。
1.2 方法
1.2.1 TLR4基因RNAi慢病毒载体构建
1.2.1.1 siRNA靶点设计 针对TLR4目的基因靶基因序列，采用Invitrogen软件（https：//rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/）设计4个RNA干扰靶点序列。见表1。
表1 TLR4 siRNA靶点设计
1.2.1.2 RNAi慢病毒载体构建 工具载体选择GV115，框架结构为hU6-MCS-CMV-EGFP，酶切位点：Age Ⅰ，EcoR Ⅰ。合成含干扰序列的DNA oligo，经退火形成双链DNA，与经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后的载体连接。见表2。
1.2.1.3 克隆制备与鉴定 通过T4 DNA ligase将酶切回收的载体和DNA片段进行链接反应，将链接产物转入制备好的DH5α细菌感受态细胞，挑取转化子重悬于10 μL LB溶液，使用GV115通用引物，进行菌落PCR鉴定实验。将PCR阳性克隆进行测序，经结果比对，确认测序引物与鉴定引物中的上游引物相同即为构建成功的TLR4目的基因RNAi慢病毒载体。测序结果通过Chromas软件进行分析。PCR鉴定阳性克隆的引物为：上游5′-CCATGATTCCTTCATATTTGC-3′，下游5′-CGCGTGGATAACCGTATTAC-3′。PCR鉴定的分组为1：阴性对照（ddH2O）；2：阴性对照（空载）；3：Marker自上而下依次为5 kb、3 kb、2 kb、1.5 kb、1 kb、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp；4：TLR4-RNAi转化子（a：Tgt-1；b：Tgt-2；c：Tgt-3；d：Tgt-4）。
1.2.2 RNAi慢病毒小量包装
制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒，分别进行高纯度无内毒素抽提，在Lipofectamine 2000介导下共转染293T细胞，培养8 h后倒去含有转染混合物的培养基，加入含10%血清的细胞培养基，继续培养48 h，收集293T细胞上清液，过滤离心后取病毒浓缩液，分装后保存在病毒管中，-80℃保存，取1支以荧光法进行病毒生物学滴度测定。
1.2.3 慢病毒感染细胞
1.2.3.1 细胞培养 实验细胞大鼠肺巨噬细胞株NR8383购自ATCC公司，培养于含15%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 μg/mL）、L-谷氨酰胺（2 mmo/L）、NaHCO3（1.5 g/L）的Ham′s F12培养基中，细胞在37℃、5%CO2条件下培养，在对数生长期进行实验。
1.2.3.2 NR8383细胞慢病毒感染 将处于对数生长期的大鼠肺泡巨噬细胞NR8383进行胰酶消化，制成细胞悬液，接种于6-well培养板培养，待细胞融合度达到约30%，按设计组别分别加入慢病毒颗粒进行NR8383细胞的感染实验，12 h后观察细胞状态，如无明显细胞毒性，连续培养24 h后更换培养基。感染3 d后荧光显微镜下观察GFP表达，荧光率达80%以上，收集细胞，感染效率低于80%的实验组，重新进行感染实验。见表3。
1.2.4 qPCR内源筛靶
收集生长状态良好的目的细胞，提取RNA，总RNA抽提根据Trizol操作说明书进行。RNA逆转录获得cDNA，按照M-MLV操作说明书进行，采用RT-PCR检测目的基因的表达情况。TLR4上游引物序列：5′-ATGAGGACTGGGTGAGAAACG-3′，下游引物序列：5′-ATGCCAGAGCGGCTACTCA-3′，扩增长度：247 bp；内参GAPDH上游引物序列：5′-TTCAACGG-CACAGTCAAGG-3′，下游引物序列：5′-CTCAGCAC-CAGCATCACC-3′，扩增长度：114 bp。用TP800序列检测系统软件（TaKaRa公司）制作扩增曲线并进行数据分析，依据2-ΔΔCt数据分析法，比较各组TLR4基因mRNA表达水平。
1.2.5 有效靶点慢病毒大量包装及验证内源性目的基因表达敲减
根据RT-PCR结果，筛选出敲减效率最高的1个RNAi有效靶点，进行慢病毒大量包装。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 阳性克隆的PCR鉴定
载体上的引物进行PCR鉴定阳性克隆，经琼脂糖凝胶电泳检测其大小和完整性，每个序列阳性克隆各取3个样品菌种送上海美季公司测序，结果通过Chromas软件进行分析。鉴定电泳结果显示，TLR4 vshRNA片段已经成功插入质粒，挑选的阳性克隆菌液测序结果与实验要求的DNA序列完全一致。见图1。
2.2 慢病毒滴度测定
测定前1 d为293T细胞铺板，每孔加4×104个细胞，在Eppendorf管中加入90 μL无血清培养基，将10 μL病毒原液加入到第1个管中，混匀后取10 μL加入到第2个管中，如此分别稀释为1/10～1/100万，感染293T细胞，24 h后加入完全培养基100 μL，4 d后，观察绿色荧光蛋白表达，通过GFP阳性细胞计数法测定LV-TLR4-RNAi（Tgt-1、2、3、4）的滴度分别为5×108、4×108、4×108、5×108 TU/mL。
2.3 慢病毒感染细胞
感染后16 h更换培养基，感染后96 h荧光拍照。图2显示各组慢病毒成功感染NR8383细胞。
图2 荧光显微镜下慢病毒感染NR8383细胞GFP的表达（100×）
2.4 RT-PCR内源筛靶
RT-PCR检测结果显示，NR8383细胞中，相对于阴性对照组，KD2组TLR4基因敲减效率达到65%（P < 0.05）（图3，封三），认为是KD2有效靶点。
2.5 病毒大量包装后的靶点再次验证
根据RT-PCR筛选结果，选取敲减效率最高的KD2号靶点进行病毒的大量包装后，经定量PCR测定，在NR8383细胞中，相对于NC、KD2组TLR4基因敲减效率达到90.1%（P < 0.05）。
3 讨论
ALI发病的关键是一种肺内过度性、失控性的炎性反应，多种炎症细胞和炎症介质相互的激活与释放，导致瀑布式的炎性反应，形成肺的过度损伤[6-7]。研究表明，ALI患者TLR4的表达水平与急性肺部炎症程度及气道上皮细胞的损伤、肺部中性粒细胞增加相关[8]。TLR4可以早期识别侵入体内的细菌启动炎性反应，核因子（NF）-κB、激活蛋白-1（AP-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）等的激活均为其下游事件，最终导致多种炎性因子的瀑布式释放，放大炎症效应[9]。研究证实，TLR4基因缺陷小鼠对内毒素的敏感性明显下降，肺组织病理损伤和肺水肿程度减轻[10]，以TLR4基因为靶点，从上游调控这种瀑布式的炎症效应，可为治疗急性感染性疾病提供一种新的策略[11]。
RNAi技术是近年来发现的一种重要的基因沉默技术，RNAi能够非常特异地降解与之序列相应单个内源基因mRNA，相对少量的dsRNA就可以使表型达到缺失突变体程度，抑制基因表达效率很高[12-14]，已成为研究信号传导通路的良好工具。RNAi技术在调节免疫系统增强免疫反应、控制炎症和治疗自身免疫性疾病中都发挥了作用[15]。
RNAi的沉默效应与基因的转染效率密切相关[16]。基因转染的方法可分为病毒转染和非病毒转染，常用的病毒载体包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒载体[17]。慢病毒载体是以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒（HIV-1）为基础发展起来的基因治疗载体，可感染分裂细胞及非分裂细胞，转移基因片段容量较大，目的基因表达时间较长，还可整合到宿主细胞的染色体基因组上，不易引发宿主免疫反应[18-20]，已成为基因功能研究及基因治疗领域中热门的基因转移载体[21]。
本研究成功构建了4个TLR4基因RNAi慢病毒表达载体，具有较高滴度，4种慢病毒载体感染大鼠肺巨噬细胞NR8383后，TLR4基因mRNA表达量均明显下降，其中LV-TLR4-RNAi（Tgt-2）抑制作用最明显，使mRNA表达下降65%，将2号靶点进行病毒的大量包装后，TLR4基因敲减效率达到90.1%，表明本研究构建的慢病毒RNAi表达载体在NR8383细胞内能有效地沉默TLR4基因表达，为后续研究TLR4信号通路在ALI发病过程中的作用及中药干预的靶点奠定了基础。
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（收稿日期：2015-06-08 本文编辑：李亚聪）
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