CEACAM-1在结直肠癌中的表达及与肿瘤血管生成、转移的相关性研究

[摘要] 目的 探討癌胚抗原相关细胞黏附分子1（CEACAM-1）在结直肠癌中的表达及与肿瘤血管生成、转移之间关系，探讨其作为结直肠癌的诊断、治疗及预后评价监测指标的可行性。 方法 收集2016年1月～2017年1月舟山市妇幼保健院普外科手术切除的50例结直肠癌组织和50例正常结直肠组织，用免疫组化法检测CEACAM-1和血管内皮生长因子（VEGF）的表达情况，同时观察微血管密度值（MVD），分析三者与肿瘤临床病理特征之间的关系及三者之间的相关性。 结果 CEACAM-1和VEGF在结直肠癌组织中阳性表达明显高于正常组织中的表达，差异有高度统计学意义（P = 0.000）;结直肠癌组织中MVD值明显高于正常组织，差异有高度统计学意义（P = 0.000）;结直肠癌组织中CEACAM-1、VEGF的表达和MVD值均与结直肠肿瘤分化程度、浆膜浸润、TNM分期、脉管浸润、淋巴结转移及肝转移相关（P < 0.05）;结直肠癌组织中CEACAM-1和VEGF阳性表达组中MVD值显著高于阴性组（P < 0.01）;CEACAM-1与VEGF在结直肠癌组织中的表达呈正相关性（r = 0.483，P < 0.001）。 结论 CEACAM-1高表达能诱导肿瘤微血管的生成，与结直肠癌的浸润及血行转移关系密切，CEACAM-1可作为结直肠癌早期诊断、预后监测的潜在分子生物学指标。

[关键词] 结直肠癌;癌胚抗原相关细胞黏附分子-1;血管内皮生长因子;微血管密度;相关性

[中图分类号] R735.37;R735.35          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）01（b）-0094-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of CEACAM-1 and the correlation with the tumor angiogenesis and metastasis， and explore feasibility as a monitoring indicator for the diagnosis， treatment and prognosis in evaluating colorectal carcinoma. Methods Fifty specimens of colorectal adenomacarcinoma tissues and 50 specimens of normal colorectal tissues from January 2016 to January 2017 in the Department of General Surgery， Maternal and Child Health Hospital of Zhoushan City were collected. The expression of CEACAM-1， VEGF was detected by immunohistochemistry method， and the value of micro-vascular density （MVD） was observed. The correlation between clinicopathologic features of tumors and expression of CEACAM-1， VEGF and MVD value， as well as the correlation among the three indices was analyzed. Results The positive expression of CEACAM-1 and VEGF in colorectal carcinoma tissues were significantly higher than those in normal tissues， and the differences were highly significant （P = 0.000）; MVD value in colorectal carcinoma tissues was significantly higher than that of normal tissue， and the difference was highly significant （P = 0.000）; the expression of CEACAM-1， VEGF and MVD value were correlated to degree of colorectal tumor differentiation， tumor serous membrane infiltration， TNM staging， vascular infiltration， lymph node metastasis and liver metastasis （P < 0.05）; MVD value of CEACAM-1 and VEGF positive expression groups was significantly higher than that of the negative group in colorectal carcinoma tissues （P < 0.01）; the expression of CEACAM-1 and VEGF were positively correlated in colorectal carcinoma tissues （r = 0.483， P < 0.001）. Conclusion The high expression of CEACAM-1 can induce the formation of tumor microvasculature， and is closely related to the tumor infiltration and metastasis. CEACAM-1 can be used as a potential molecular biological indicator for early diagnosis and prognosis in monitoring colorectal carcinoma.

[Key words] Colorectal carcinoma; CEACAM-1; VEGF; Microvessel density; Correlation

当前结直肠癌的治疗主要以手术为主，而手术的前提则是强调早期发现，因此高特异性的生物学指标对结直肠癌的早期发现、早期诊断、早期治疗有极其重要的价值。肿瘤细胞的生长依靠新生血管为其提供新陈代谢的基本物质，肿瘤血管密度越大，血供越丰富，生长就越快，转移风险也越高[1]。癌胚抗原相关细胞黏附分子-1（cancer embryo antigen-related cell adhesion molecules 1，CEACAM-1）作为癌胚抗原家族重要成员之一，能调控细胞增殖、凋亡和分化，同时介导肿瘤细胞的黏附，还参与了血管淋巴管新生等病理生理过程[2]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在人体的多种恶性肿瘤中呈高表达，它最主要的作用就是诱导基质血管形成，并且与多种因子具有协同作用，除此之外还对血管内皮细胞的增殖有促进作用[3]。CD34在肿瘤血管内皮细胞中呈特异性表达，被广泛用于标记肿瘤内的微血管密度（microvascular density，MVD）[4]。本实验就是通过对CEACAM-1、VEGF进行免疫组化分析，记录MVD值，来探讨三者与结直肠癌病理的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

标本取自舟山市妇幼保健院（以下简称“我院”）普外科2016年1月～2017年1月原发性结直肠癌手术切除的癌组织50例，正常结直肠组织50例（癌组织取自至癌灶边缘至少10 cm处）。本研究经我院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 纳入标准

经病理检查确诊，均为原发瘤，且病例资料完整无误。

1.3 排除标准

进行过术前新辅助放化疗;转移瘤;复发性肿瘤;伴有心脑血管疾病及其他手术禁忌证者。

1.4 仪器与试剂

兔抗人浓缩型CEACAM-1单克隆抗体、鼠抗人单克隆浓缩型VEGF抗体由香港ABCAM公司提供，CD34抗体由美国ABNOVA公司提供。

1.5 免疫组化染色方法

10%的甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片厚度4 μm，应用苏木精-伊红染色，行病理诊断。用80℃烤箱对切片进行烘烤30 min，再用乙醇进行脱水，并使内源性过氧化物酶灭活，应用枸橼酸缓冲液行高温高压水化修复过程;PBS洗3次，加入一抗（1∶100）50 μL，温度控制于4℃一夜;再用PBS洗3次，加入二抗50 μL。室温下DAB显色，PBS洗3次，苏木精轻度复染，盐酸乙醇分化后流动清水冲洗10 min，梯度乙醇脱水，松节油透明，树胶行封片处理，PBS代替一抗作为阴性对照，光镜下观察[5]。

1.6 判定标准

CEACAM-1和VEGF阳性主要存在于细胞质中，以棕黄色、褐色颗粒为主，计算阳性细胞百分比评分：0分（<5%）为（-），1～4分（5%～<25%）为（+），5～8分（25%～<50%）为（++），9～12分（≥50%）为（+++），（+）～（+++）均视为阳性[6]。

应用CD34抗体标记肿瘤微血管细胞质，依据Weidner法[7]，于200倍光镜下取4个热点区，以孤立的棕黄色内皮细胞作为微血管并计数，取其平均值即为MVD值。

1.7 统计学方法

应用SPSS 19.0统计软件分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验;计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验。采用Pearson法进行相关性分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CEACAM-1、VEGF和MVD在结直肠癌、正常结直肠组织中的比较

CEACAM-1和VEGF在结直肠癌组织中的阳性表达明显高于正常组织中的表达，结直肠癌组织中MVD值明显高于正常组织，差异均有统计学意义（P = 0.000）。表1。

2.2 病理参数与CEACAM-1、VEGF表达水平及MVD的相关性分析

TNM分期高、浆膜浸润、伴淋巴结转移、肝转移和脉管浸润的结直肠癌患者CEACAM-1和VEGF的表达均增强，MVD值均增高（P < 0.05），而三者的表达与患者肿瘤大小、分化程度无关（P > 0.05）。见表2。

2.3 CEACAM-1、VEGF在结直肠癌组织中的表达与MVD的相关性分析

結直肠癌中CEACAM-1阳性者MVD值明显高于CEACAM-1阴性者，结直肠癌中VEGF阳性者MVD值明显高于VEGF阴性者，差异均有统计学意义（P = 0.000）。相关性分析结果显示，二者在结直肠组织中的表达呈正相关（P < 0.001）。见表3～4。

3 讨论

据报道青年结直肠癌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者，其5年生存率分别为87.9%、75.4%、51.3%、8.0%，而60岁以上老年患者的5年生存率则分别为91.9%、69.8%、52.8%、6.6%，因此早期诊断是提高结直肠癌疗效的关键[8-9]。但目前临床常用的肿瘤标志物如癌胚抗原（CEA）、糖类抗原（CA）-199等的早期检测并不令人满意，因而，寻求一种特异性高、敏感性强的结直肠癌早期诊断方法成为目前结直肠癌防控工作的重点[10]。

CEACAM-1是一种跨膜糖蛋白，属于癌胚抗原家族及免疫超蛋白家族黏附分子之一，在人体内皮细胞、上皮细胞、淋巴细胞等多种细胞中都有较为广泛的分布。最初由Ocklind等[11]在研究木瓜蛋白酶质膜的不溶性成分的某些作用和功能时被发现。CEACAM-1基因定位于人类染色体的19q13.2区域，该基因的组成是由9个外显子按特定序列排列而成，在11种剪切方式下，可以生成11个不同的亚型，根据胞内段的长短可分为CEACAM-1-L和CEACAM-l-S两个亚组[12]。CEACAM-1-L亚组可以形成特定的反式二聚体，聚集在细胞间，介导细胞间的黏附[13-14]。随着深入研究发现，CEACAM-1还参与了多种复杂的生物学过程，比如它可以参与调节细胞的增殖、凋亡及分化，并对胰岛素代谢、微血管及微淋巴管的新生和免疫调节等生理过程具有重要作用[15]。且多项研究证实CEACAM-1参与了肿瘤发生、发展、浸润与转移等一系列生物学过程，其异常表达可能是引起和维持结直肠癌恶性表型的原因之一[16]。此外，研究表明CEACAM-1参与肿瘤微血管的异质性生成过程，因此考虑其是肿瘤新生血管的标志物，可作为肿瘤靶向治疗的靶点[17]。

VEGF在人体的多种恶性肿瘤中呈高表达，无论是原发性还是继发性肿瘤，且VEGF表达水平与肿瘤组织中的MVD呈正相关，因此通过阻碍VEGF的信号传导可以抑制肿瘤血管的生成，阻断肿瘤的营养供应渠道，从而延缓甚至阻碍肿瘤的发生和发展[18-19]。

本项研究显示CEACAM-1和VEGF在结直肠癌组织标本中的表达明显高于正常结直肠组织标本，说明CEACAM-1和VEGF的高表达可以促进肿瘤的发生和发展，影响肿瘤的大小和浸润深度，使肿瘤对周围组织器官的侵袭能力增强，淋巴结转移更快，除此之外还可以发现二者与肿瘤的TNM分期密切相关，影响肿瘤细胞的分化，对结直肠癌患者的预后产生极为重要的作用。与此同时，CEACAM-1可以直接激活VEGF，从而增加MVD值，对肿瘤内部血管的生成起到促进作用，为肿瘤细胞的生长提供充足的营养，使得肿瘤细胞生长更快、侵袭能力更强。本研究支持CEACAM-1和VEGF促进结直肠肿瘤恶性生物学行为进展的理论，与吴涛等[20]研究基本一致。

总之，CEACAM-1的表达异常不仅直接参与了结直肠癌的发生、发展，还间接激活VEGF，促进肿瘤血管新生，增加MVD值，进而影响肿瘤的淋巴转移、血行转移等恶性生物学行为。因此，在提倡精准治疗的今天，以CEACAM-1为靶点研究相应的靶向药物将有望成为治疗结直肠癌的重要基因手段。

[参考文献]

[1]  史刚刚，郝敬鹏，王力何，等.结直肠癌组织中血管抑制蛋白1表达的临床意义及其与血管内皮生长因子A和微血管密度的相关性[J].中华胃肠外科杂志，2015，18（3）：272-276.

[2]  Gebauer F，Wicklein D，Horst J，et al. Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecules（CEACAM）1，5 and 6 as biomarkers in pancreatic cancer [J]. PLoS One，2014，9（11）：e113023.

[3]  Zhang L，Mai HM，Zheng J，et al. Propranolol inhibits angiogenesis via down-regulating the expression of vascular endothelial growth factor in hemangioma derived stem cell [J]. Int J Clin Exp Pathol，2014，7（1）：48-55.

[4]  武雪亮，王立坤，薛军，等.DNA结合分化抑制蛋白1和血管内皮生长因子的表达及其与肿瘤微血管生成的相关性研究[J].中国临床药理学杂志，2016，32（5）：430-436.

[5]  王子昕，盛伟伟，董明，等.结合基序蛋白6在结直肠癌组织中的表达及临床意义[J].中国实验诊断学，2017，21（5）：765-768.

[6]  许良中，杨文涛.免疫组织化学反应结果的判定标准[J].中国癌症杂志，1996，6（4）：229-231.

[7]  Weidner N，Folkman J，Pozza F，et al. Tumor angiogenesis：a new signifincant independent prognostic indicator in early stage breast carcinoma [J]. J Nail Cancer Inst，1992， 84（9）：1875-1887.

[8]  兰蓝，赵飞，蔡玥，等.中国居民2015年恶性肿瘤死亡率流行病学特征分析[J].中华流行病学杂志，2018，39（1）：32-34.

[9]  詹天成，顾晋.NCCN2016V1版直肠癌诊治指南更新及其解读[J].实用肿瘤杂志，2016，31（4）：291-295.

[10]  郑树，张苏展，黃彦钦.结直肠癌研究30年回顾和现状[J].实用肿瘤杂志，2016，31（1）：2-5.

[11]  Okegawa T，Pong RC，Li Y，et al. The role of cell adhesion molecule in cancer progression and its application in cancer therapy [J]. Acta Biochim Pol，2004，51（2）：445-457.

[12]  Dupuis ML，Fiori V，Soriani A，et al. The Human Antibody Fragment DIATHIS1 Specific for CEACAM-1 Enhances Natural Killer Cell Cytotoxicity Against Melanoma Cell Lines In Vitro [J]. J Immunother，2015，38（9）：357-370.

[13]  Lu R，Kujawski M，Pan H，et al. Tumor angiogenesis mediated by myeloid cells is negatively regulated by CEACAM-1 [J]. Cancer Res，2012，72（9）：2239-2250.

[14]  Zippel D，Barlev H，Ortenberg R，et al. A longitudinal study of CEACAM-1 expression in melanoma disease progression [J]. Oncol Rep，2015，33（3）：1314-1318.

[15]  Bennett DC，Cazet A，Charest J，et al. MPDU1 regulates CEACAM1 and cell adhesion in vitro and in vivo [J]. Glycoconj J，2018，35（3）：265-274.

[16]  Zheng J，Hernandez JM，Doussot A，et al. Extracellular matrix proteins and carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecules characterize pancreatic duct fluid exosomes in patients with pancreatic cancer [J]. HPB（Oxford），2018，20（7）：597-604.

[17]  馬赛，安峰，胥爱文，等.CEACAM1和VEGF在涎腺黏液表皮样癌中的表达及在血管生成中的作用[J].河北医科大学学报，2017，38（1）：43-47.

[18]  Paudyal B，Paudyal P，Shah D，et al. Detection of vascular endothelial growth factor in colon cancer xenografts using bevacizumab based near infrared fluorophore conjugate [J]. J Biomed Sci，2014，21（11）：35-46.

[19]  An Y，Liu WJ，Xue P，et al. Autophagy promotes MSC-mediated vascularization in cutaneous wound healing via regulation of VEGF secretion [J]. Cell Death Dis，2018，9（2）：58-65.

[20]  吴涛，徐亮，杨志惠.结直肠癌中CEACAM1、VEGF的表达及与血管生成的关系[J].现代中西医结合杂志，2016，25（33）：3666-3668.

（收稿日期：2018-07-22  本文编辑：金   虹）