核磁共振波谱法在多糖结构分析中的应用

摘要：多糖由于结构复杂使解析结构非常繁琐和困难，使对各种多糖的深入研究受限。核磁共振波谱法（NMR） 是解析物质结构最有效的手段，近年该技术的发展也很迅速。本文综述了一维核磁共振（1D-NMR）和二维核磁共振波谱法（2D-NMR，包括COSY，TOCSY，ROESY，NOESY， HMQC，HSQC与HMBC）在多糖结构分析中的应用。这些技术可以提供如多糖的单糖组成、单糖残基间的顺序、单糖残基在糖苷键中的位置、环状结构的类型和糖苷键的构型等许多信息，成为分析多糖结构不可缺少的工具。

关键词：核磁共振波谱法；多糖；结构分析

中图分类号：Q532文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)08-0039-05

多糖是生物体内普遍存在的一类生物大分子，糖结合物在细胞识别、细胞间物质运输和调节免疫功能等方面具有重要的功能。目前已从多种生物体中提取了多种活性多糖，发现它具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、降血糖、降血脂等作用。因此，多糖的研究引起了越来越多的重视[1,2]。

结构是多糖活性的基础，多糖一级结构的研究包括单糖残基的种类和顺序，多糖残基在糖苷键中的位置，环状结构的类型和糖苷键的构型。而组成多糖的单糖品种繁多，单糖的连接顺序、连接位置的不同以及是否存在侧链使多糖结构更具复杂性，其结构鉴定也更困难。目前常用的多糖结构分析方法主要分为化学分析法、生物学分析法和物理分析法3大类，其中物理分析法包括核磁共振波谱（NMR）、红外光谱、质谱、X-射线衍射光谱等。现将近年来核磁共振波谱在多糖结构分析中的应用进展作一综述。

1一维核磁共振

NMR检测组成有机化合物分子的原子核性质及其与周围化学环境的相互作用，一维核磁共振氢谱（1H-NMR）和一维核磁共振碳谱（13C-NMR）可为多糖的结构分析提供有用的信息。

1.11H-NMR

多糖上的羟基信号峰较宽，化学位移值（δ）可变，干扰其它氢信号，所以常通过重水交换除去。糖环碳上大部分质子的化学位移由于受羟基的屏蔽作用而位于3~4 ppm范围内，信号重叠严重，解析困难。但异头氢质子H-1的化学位移处于较低场，在4.5~5.5 ppm，一般情况下，此区域内有几个质子信号，表示有几种单糖种类；α型吡喃糖H-1质子化学位移大于4.95 ppm，β型吡喃糖H-1质子化学位移小于4.95 ppm，借此可以判断糖环的构型。如Jia等[3]从猴头菇中得到一杂多糖，1H-NMR中有3个异头氢信号，δ4.50 ppm、δ4.95 ppm和δ5.05 ppm，提示由3种单糖组成，结合化学分析和文献，分别为D-葡萄糖（β构型）、D-半乳糖（α构型）和L-鼠李糖（α构型）。糖环的构型也可由异头质子与邻位质子的偶合常数（J）来推断，异头质子与邻位质子处于垂直键-平伏键或平伏键-平伏键方向时，J为1~4 Hz，处于垂直键-垂直键方向时，J为6~10 Hz。如从真菌Termitomyces eurhizus的子实体中得到的葡聚糖PS-Ⅰ，1H-NMR中异头质子与邻位质子的J为3 Hz，表明其葡萄糖残基均为α构型[4]。解析图谱时一般先找出容易辨认的质子信号，如异头质子，再通过相同偶合常数的信号来确定其邻位质子。

1.213C-NMR

13C-NMR的化学位移范围较1H-NMR广，达300 ppm，具有较好的分辨率，并且许多文献中有单糖、寡糖和多糖的碳谱数据[5]，可用于对比确定各种碳的化学位移。和1H-NMR一样，糖的异头碳位于较低场，δ95~110 ppm，此范围内有几个信号，表示有几种单糖组成。需要注意的是，同一种单糖在多糖中的位置不同，可能会导致异头碳不同的化学位移，一般比较接近，几乎重叠[6]。取代基不同的空间排列对化学位移有较大的影响，异头碳上取代基为垂直键比为平伏键的化学位移处于较高场，据此可以判断糖环的构型，如D-葡萄糖，α型δ97~101 ppm，β型δ103~106 ppm[7]。另可根据苷化位移规则，即糖上羟基被其它基团取代后其相连羟基碳的化学位移向低场移动，确定多糖残基中的取代位置和分枝点的位置。

Jansson等[8]设计的计算机程序CASPER，用于测定具有有序重复单元的多糖结构。该程序利用多糖的13C-NMR及单糖和甲基化分析的信息，基于重复单元中单糖的特性和不同连接位置的差异，构建出所有可能的排序。借助从二糖获得的13C-NMR化学位移数据，模拟出可供选择的结构波谱，从中筛选出与所测未知多糖波谱最一致的结构。该程序验证了2个已知多糖，均得到了正确的结构。后来发展的CASPER扩展版本，利用1H-NMR及2D-NMR的信息，可以测定具有分枝的复杂多糖的结构。验证了4个已知多糖，有3个多糖的结构被正确推导出，第4个多糖测定出与NMR相一致的有2个，其中有一个是正确的结构。该程序在后来的多糖结构分析中也得到了应用[9]。

2二维核磁共振（2D-NMR）

2D-NMR是有两个时间变量，经两次傅里叶变换得到两个独立的频率变量的谱图。多糖中相同原子的化学环境差别不大，信号重叠严重，利用2D-NMR技术，可以使难以辨认的信号得到确认，并可得到多糖分子的构型及构象方面的信息。

2.1COSY

COSY（correlation spectroscopy，相关能谱法）包括H,H-COSY和C,H-COSY。H,H-COSY提供的是分子中氢原子与氢原子间通过化学键的偶合关系，包括质子间孪生（2JHH）、邻位（3JHH）或远程如烯丙位和W形（ 4JHH）的偶合，一般没有质子间的空间偶合关系。偶合常数越大，偶合峰越强。通过糖上质子间的偶合关系，可从容易辨认的质子（如异头质子或甲基质子）开始，寻找糖上其它碳位的质子。来源于Angelica sinensis (Oliv.) Diels [10]的a-D-(1→6)-葡聚糖，由H,H-COSY归属了每个质子信号。Kilcoyne等[11]从Pseudoalteromonas rubra ATCC 29570中得到一个复杂的多糖，采用二维COSY，使每个质子的信号得到了确认。

C,H-COSY是1H和13C核之间的位移相关谱，它将直接相连的1H和13C核关联起来。揭示出哪个H原子连接于哪个C原子，一个C原子上连接几个H原子。由于13C-NMR信号具有比1H-NMR信号化学位移散布宽的特点，一些在1H-NMR中十分拥挤区域中的质子信号在C,H-COSY中随化学位移分布极宽的13C-NMR信号而散开，大大简化了1H-NMR信号的解析。

2.2TOCSY

TOCSY（total correlation spectroscopy，总相关能谱法）是分子内氢偶合链的接力相干信息，如果偶合常数较大，其信息会象接力赛一样沿着碳链传递，中止于偶合常数小的部位。如β-葡萄糖型残基中的质子都是反式垂直键，相邻质子间偶合常数较大，为7~10 Hz，在TOCSY中异头质子信号不仅显示与2位质子间的直接偶合相关峰，还显示出与3,4,5位质子间的接力相关峰；半乳糖型残基的4位质子为平伏键，与3位和5位质子间的偶合常数较小，1~4 Hz，在TOCSY中异头质子信号除显示与2位质子直接偶合相关峰外，只显示出与3,4位质子间的接力相关峰，信号的传递在4位中止。因此，根据TOCSY的特征可以判断糖残基的类型。TOCSY实验结合COSY能够克服质子信号重叠无法解析的困难，只要从该偶合链中选择一个分辨良好、不与其它信号重叠的信号作为解析起点，便可以鉴定属于该偶合链的所有氢信号。

如从Rhodococcus sp.33[12]中得到的一个杂多糖，其单糖组成从TOCSY图谱特征中得到证实，并由其确定了各质子的化学位移值，其中单糖残基A为半乳糖，H-1（δ4.48）显示与H-2（δ3.64），H-3（δ3.78），H-4（δ4.16）的相关；单糖残基B为葡萄糖，H-1（δ4.63）显示与H-2（δ3.41）、H-3（δ3.67）、 H-4（δ3.63）、H-6a（δ3.78）、 H-36b（δ3.78）的相关；单糖残基C为甘露糖，H-1（δ4.66）只显示与H-2（δ4.18）的偶合相关；单糖残基D为葡萄糖醛酸，H-1（δ4.69）显示与H-2（δ3.46）、H-3（δ3.65）、H-4（δ3.75）的相关。Proteus mirabilis O40的脂多糖经缓和酸水解后，分离到一个O-多糖，建立在偶合常数J2,3、J3,4、J4,5的基础上，从其COSY和TOCSY谱中鉴定了一个半乳糖和两个乙酰氨基葡萄糖的自旋系统，并从偶合常数J1,2判断出单糖的构型[13]。Larocque等[14]从Bordetella arium中得到的O-多糖，通过COSY和TOCSY实验证实了葡萄糖残基的存在，确定了其构型。因此，TOCSY对于解析有许多重复结构单元、氢信号重叠严重的多糖分子非常有用。

2.3NOESY与ROESY

分子内质子与质子间空间相互接近会产生核交叉驰豫现象，称作NOE效应（nuclear Overhauser effect，核欧沃豪斯效应）。H,H-NOESY（nuclear Overhauser effect spectroscopy）揭示的就是这种质子与质子间在空间的相互接近关系，而非通过键的偶合。如β-葡萄糖的质子都是反式垂直键，邻位质子处于糖环不同的方向，在NOESY中不会出现NOE相关峰，而间位质子由于空间距离接近，会有NOE相关峰出现。根据这些谱学特征，结合其它二维谱，可以确认不同的单糖残基。多糖中相连的两单糖残基间，异头质子与另一单糖残基相连位质子间由于空间接近，会产生NOE效应，在NOESY中出现相关峰，可以推断单糖残基间的连接顺序和连接位置[15,16]。Larocque等[14]从Bordetella arium中得到的O-多糖，单糖残基内（H2,H4）和（H3,H5）强的NOE效应证实了葡萄糖残基的存在，（H1,H3）和（H1,H5）强的NOE效应表明它是β-构型，而（H1,H4）NOE相关峰的出现为1,4-糖苷键的特征。Mondal等[4]从食用蘑菇Termitomyces eurhizus的子实体中得到两个多糖PS-Ⅰ和PS-Ⅱ，通过NOESY实验确定了单糖残基间的连接顺序。

ROESY（rotating frame Overhauser effect spectroscopy）是旋转坐标系（rotating frame）中NOESY的缩写，是在自旋锁定条件下测定的H,H之间的NOE相关。对于复杂的天然产物，利用NOESY测定，NOE相关信号往往很少，不利于结构解析，用ROESY则可得到改善，不会出现相关峰强度为零的情况，可以得到更多的NOE相关信号。Providencia stuartii O44中得到的O-多糖，其ROESY揭示了各个残基间的相关，α-Fuc H-1，α-Glc H-3在δ5.27/3.78；α-Glc H-1，α-Qui H-4在δ5.03/3.26；α-Qui H-1，α-GlcNAc H-3在δ5.01/3.88；α-GlcNAc H-1，α-GalNAc H-4在δ4.86/4.02；α-GalNAc H-1，α-Fuc H-3在δ5.24/4.05；β-GlcA H-1，α-Fuc H-4在δ4.55/4.11，证实了重复单元中单糖残基间的连接顺序和连接位置[17]。

2.4HMQC，HSQC与HMBC

HMQC（heteronuclear multiple quantum coherence，异核多量子相干），把1H核和与其直接相连的13C核关联起来，检测C，H之间的1JCH相关关系。HSQC（heteronuclear single quantum coherence，异核单量子相干）与HMQC比较，只是技术不同，所得到的信息与HMQC相同，检测C，H之间的1JCH相关关系。通过HMQC或HSQC，可以找出与异头碳质子相连的碳的信号及糖基上每个质子所连接的碳的信号。由Providencia alcalifaciens O29[18] 脂多糖温和酸降解得到的O-多糖，其HSQC图谱揭示了直接相连C，H之间的相关，δ98.2处的C信号分别与δ5.08, δ4.79的H信号有偶合关系，提示δ98.2为两个异头碳的重叠峰，结合甲基化分析和其它二维谱，使得每个C、H的信号得到归属。

HMBC（heteronuclear multiple bond coherence,即异核多键相关），把1H核和远程偶合的13C核关联起来，检测相隔2键或3键的C，H之间的2JCH或3JCH相关关系。与普通的C,H -COSY的区别是，HMQC、HSQC和HMBC是通过丰度较高的H检测的H , C-COSY，大大提高了NMR方法的检测灵敏度。通过HMBC，可以获得跨越糖苷键的远程H， C相关信息，即相连的两单糖残基间，异头质子与另一单糖残基相连位碳的偶合关系，从而推断单糖残基间的连接顺序和连接位置[ 19]。如从Coprinus comatus菌丝体[20]中得到一岩藻半乳糖CMP3，其HMBC不仅显示出每个单糖残基内（A、B、C、D、E）H-1与C-2、C-3、C-5相隔2键、3键的偶合相关，尚揭示了单糖残基间H-1（A）/C-2（B），H-1（B）/C-6（C），H-1（C）/C-6（E），H-1（D）/C-6（B），H-1（E）/C-6（D）的连接位置。Bao等[21]从Ganoderma lucidum孢子中得到一葡聚糖，其1H-NMR和13C-NMR谱通过HMQC和HMBC得到全部指认，并确定了单糖残基间的连接位置。从Proteus vulgaris O45 中得到一个O-多糖，通过HSQC与HMBC实验，结合其它二维谱，确认了组成多糖的各个单糖的自旋系统[22]。

3小结

多糖为大分子化合物，其结构通常是由若干个单糖组成的重复单元构成，分子内H,H之间、C,C之间的化学环境比较相似，在NMR中的信号重叠严重，因此早期的NMR应用于多糖，所提供的信息很少，并未得到足够的重视，而多糖的结构分析主要依靠于化学分析法。

近年，高磁场NMR仪的出现，使原来低磁场NMR仪上不能分辨的信号得以分开，尤其是2D-NMR的快速发展，极大的提高了谱峰的分辨率，可以提供多糖结构中单糖残基的类型、各糖残基中C、H化学位移归属，各糖残基间的连接位置和连接顺序等诸多信息，甚至可提供某些多糖结构的全部信息。因此，NMR技术在多糖中得到了广泛的应用，成为解析其结构不可缺少的工具。

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