牛病毒性腹泻病毒SYBR,Green,Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

材料与方法

1.1 毒株和样品来源

牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛肠道病毒（bovine enterovirus，BEV）、牛副流感3型病毒（bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3）、牛流行热病毒（bovine ephemeral fever virus，BEFV）等相关病毒核酸，均为山东省农业科学院奶牛研究中心疾病研究室保存。临床检测样品来自2019年山东省、江苏省、天津市的5个规模化牧场送检样品。

1.2 主要试剂与仪器

SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）试剂盒和病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，购自宝生物工程（大连）有限公司;Light Cycler 480Ⅱ荧光定量PCR仪，罗氏公司;2×Easy Taq PCR SuperMix，购自北京全式金生物技术有限公司;pClone 007 Blunt Vector Kit，购自北京擎科生物技术有限公司。

1.3 引物的设计与合成

参考GenBank中牛病毒性腹泻病毒的全基因组核酸序列，设计特异性扩增BVDV的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR引物，由北京擎科生物技术有限公司合成，引物序列如表1所示。

1.4 病毒RNA提取和cDNA合成

取200 μL BVDV病毒原液，按照病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取BVDV病毒基因组RNA，然后按照反转录试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA。

1.5 阳性标准品的制备

以提取的BVDV病毒基因组cDNA为模板，BVDV-F/R为引物进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，回收目的片段，连接至pClone 007载体，鉴定正确的重组质粒作为阳性标准品，命名为pClone 007-E2。测定质粒浓度，按照以下公式转换成质粒的拷贝数： 拷贝数=质粒浓度×10-9×6.02×1023/（660×质粒长度），将pClone 007-E2质粒进行10倍倍比稀释，放于-20℃冰箱备用。

1.6 建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法

以pClone 007-E2质粒为模板，采用方阵法对引物浓度（5～20 pmol/L）、退火温度（55～62℃）进行摸索，最终选取Ct最小值、荧光最高值、熔解曲线特异性明显的PCR反应条件。

采用优化完成的反应条件，以10倍梯度稀释后的阳性标准品pClone 007-E2为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，根据Ct值绘制标准曲线。

1.7 敏感性试验

以稀释后的标准品为模板，阴性对照以ddH2O为模板，进行BVDV的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR扩增，每个浓度的标准品做3个样本检测。同时相同浓度下进行常规PCR试验，分析对比两种方法的敏感性。

1.8 特异性試验

用已建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR反应体系，分别以BVDV、IBRV、BPIV3、BEFV、BEV的基因组作为模板，并以ddH2O为阴性对照，分析该方法的特异性。

1.9 重复性试验

分别取等量的4份不同拷贝（4.87×103 copies/μL，4.87×104 copies/μL，4.87×105 copies/μL，4.87×106 copies/μL）的pClone 007-E2重组质粒进行荧光定量PCR检测（同时设置空白对照），每份拷贝样品做3个重复，进行批内重复性试验，通过计算 Ct值的标准差（S）和变异系数（CV）验证荧光定量 PCR的批内重复性。另外，取以上4份样品，在同一反应条件下间隔7 d重复一次独立的荧光定量PCR检测，共重复3次，然后计算 Ct值的变异系数（CV），验证此方法的批间重复性。

1.10 临床样品的检测

采用本试验建立的 IBRV SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法检测5个规模化奶牛场送检的67份奶牛腹泻样品，同时利用普通PCR进行检测，比较二者的检出率，并计算二者的符合率。

2 结果与分析

2.1 质粒标准品的鉴定

以BVDV基因组cDNA为模板，利用特异性引物BVDV-F和BVDV-R进行PCR扩增，得到约185 bp左右的目的片段，与预期片段大小相同，无其他非特异性条带，阴性对照无条带（图1）。将目的基因进行回收，然后连接至pClone 007载体上。提取质粒进行测序，测序结果与NCBI登录的标准序列对比，片段插入位置正确，同源性为100%，表明标准质粒pClone 007-E2构建成功。pClone 007-E2的质粒浓度为112 ng/μL，总长度为2 096 bp，经计算拷贝数为4.87×1010 copies/μL。

2.2 SYBR Green Ⅰ 实时荧光定量PCR方法的建立

用优化后的反应条件建立标准曲线，其斜率为-3.1389，截距为30.19，相关系数为0.9931（图2），说明Ct值与10倍梯度稀释后的阳性标准品之间有良好的线性关系。

SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测 BVDV的熔解曲线显示，质粒标准品均出现了单一波峰，而阴性对照未出现熔点峰（图3），表明试验过程中没有出现引物二聚体及污染现象，且该引物为特异性扩增。

2.3 特异性试验

用建立的 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量 PCR 方法对BVDV、IBRV、BPIV3、BEFV、BEV、ddH2O进行检测，发现只有BVDV检测为阳性（图4），说明该方法有很强的特异性。

2.4 敏感性试验

将标准质粒pClone 007-E2作10倍梯度稀释，用该方法对 4.87×107 copies/μL至 4.87×100 copies/μL的标准质粒样品进行荧光定量PCR检测。由图 5可知，该方法检出核酸的最低模板拷贝数为4.87×101 copies/μL。常规 PCR能检出的核酸最低阳性质粒拷贝数为4.87×102 copies/μL（图 6）。结果表明，本试验建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的敏感性高于普通 PCR检测方法。

2.5 重复性试验

重复性试验结果（表2）表明，批内变异系数为0.07%～0.33%，批间变异系数为0.54%～0.71%，表明该方法具有良好的批内、批间重复性。

2.6 临床样本检测

采用建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法检测了5个规模化奶牛场送检的67份奶牛腹泻样品，BVDV阳性31份，阳性检出率为46.27%（31/67），而普通PCR 阳性检出率为43.28%（29/67），符合率为106.90%。

3 讨论与结论

牛病毒性腹泻病毒可引起患病牛呈现发热、流涎、下痢、结膜炎、口腔黏膜糜烂溃疡，孕牛出现流产、死胎和胎儿畸形，还会引起牛的免疫抑制以及持续性感染等问题[13]。牛病毒性腹泻病毒在世界范围内广泛流行，是影响养牛业健康发展的最重要疫病之一[14]。由于持续感染，牛可以长期带毒排毒，是非常危险的传染源[15]。因此，关于牛群的检测、监测与淘汰对于牛病毒性腹泻的控制非常重要。

本研究建立的牛病毒性腹泻病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法不仅兼具特异性好、敏感性高和重复性好等优点，而且操作简单，易于进行大规模样品检测。此外，利用本方法检测的样品采样方便，可直接检测病原，为BVDV感染的早期诊断及病原流行病学调查提供了有效可靠的技术手段。

本研究通过对NCBI上收录的多个BVDV序列进行比对，针对E2基因上的保守区域设计特异性引物，建立了SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法。用该方法检测BVDV，最低检测限为4.87×101 copies/μL，敏感性比常规PCR高10倍;检测IBRV、BPIV3、BEFV、BEV、ddH2O等均为阴性，只有检测BVDV的结果为阳性，说明该方法的特异性强;批内变异系数为0.07%～0.33%，批间变异系数为0.54%～0.71%，表明该方法重复性高。用建立的荧光定量PCR方法对山东、江苏和天津3个地区5个不同牛场的67份牛腹泻样品进行检测，结果表明，建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法阳性样本检出准确率高于常规PCR方法。

本试验建立的牛病毒性腹泻病毒E2基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法可以高效、准确地确定牛群中是否存在BVDV感染，为今后BVDV的防控和净化提供了有效的技术手段，也为BVDV的实验室研究提供了参考和理论支撑。

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