盐度对仿刺参蛋白摄入量及蛋白酶活性的影响

材料与方法

1.1 试验材料

试验所用仿刺参购于威海经济技术开发区金鑫生物科技有限公司养殖场，选购长4 cm，体重5 g左右，伸展自如，疣刺坚挺，体表无损伤，对外刺激反应迅速的幼参作为试验材料。置于自动水循环系统的培养缸中培养7 d，海水盐度2.8%，pH为8.0，水温20 ℃；提供少量饵料，摄食期间停止增氧机，保持良好水质。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂 考马斯亮蓝G250，福林试剂，0.1 mg/mL牛血清蛋白BSA，0.5%的酪蛋白溶液，磷酸盐缓冲液（pH 7.2），10%三氯醋酸，0.4 mol/mL的碳酸钠溶液，酪氨酸标准溶液等。

1.2.2 仪器 紫外分光光度计、台式高速冷冻离心机、恒温水浴锅、烘箱、冷冻柜等。

1.3 试验方法

1.3.1 梯度设置 分别设置2.2%、2.5%、2.8%、3.1%、3.4% 5个盐度梯度，用海盐和曝气自来水进行调节。海参样品运回实验室后，在盐度为2.8%的海水中暂养；用进行不同盐度的驯化，定时巡池，观看仿刺参的摄食及生活状态。

1.3.2 样品制备

1）残饵收集。进入试验阶段后，每天16：30投喂海参重量2%的饵料（饵料∶干海泥=1∶5），并于第二天9：00用虹吸法清除池内粪便和残饵作为样品，带回实验室，用烘箱烘干，备用。

2）粗酶液制备。取新鲜的海参解剖取出消化道，用冷却去离子水洗净后，按1 g肠道加入1 mL的磷酸缓冲液（pH 7.5），将匀浆液在4 ℃下10 000 r/min离心30 min，取上清液，冷冻柜中储存备用。

1.3.3 测定方法

1）考马斯亮蓝法测定蛋白摄入量。仿刺参蛋白摄入量=投喂蛋白量-残饵及粪便蛋白量。考马斯亮蓝法测定饵料和样品（残饵粪便）蛋白含量，用1.0 mg/mL的标准蛋白质溶液给各试管分别加入0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL，然后用去离子水补至0.1 mL，各试管中再分别加入5.0 mL考马斯亮蓝G250试剂。稍加摇动，混合均匀2 min后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595 nm处的吸光度，空白对照试管，即0.1 mL H2O加5.0 mL G250试剂。饵料及收集样品烘干后用磷酸缓冲液（pH 7.2）进行溶解，离心后取1 mL上清液按上述方法并从标准曲线上查得蛋白含量。以标准蛋白质量（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标，即得到标准曲线。根据测出的未知样品的吸光度，可查出未知样品的蛋白质含量[6]，并利用表观消化率分析盐度对仿刺参蛋白摄入量的影响，表观消化率=（投喂总蛋白含量-残饵和粪便蛋白量）/投喂蛋白总量×100%。

2）福林-酚试剂法测定仿刺参消化道蛋白酶活力。向试管中加入0.5%的酪蛋白溶液2.0 mL和磷酸盐缓冲液（pH 7.2） 4.0 mL，在40 ℃下保温5 min，然后加入粗酶提液1.0 mL，保温20 min，立即加入10%三氯醋酸2.0 mL终止反应。取出3 000 r/min心10 min后的上清滤液1 mL，加入0.4 mol/L的碳酸钠溶液5.0 mL，再加入1.0 mol/L的福林试剂1.0 mL，于40 ℃恒温水浴中显色20 min，在分光光度计680 nm波长下比色测定，以蒸馏水校零作为参照，对照管在加入粗酶提液前先加入2.0 mL 10%的三氯醋酸使酶失活，其他同测定管[7]。

蛋白酶活力单位定义：在pH 7.2和40 ℃下保温20 min，1 g仿刺参消化道 1 min水解0.5%的酪蛋白产生1 g酪氨酸即为1个蛋白酶活力单位。

1.4 數据分析

样品的数据均采用SPSS软件进行处理，进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 盐度对仿刺参蛋白摄入量的影响

利用表观消化率进行分析，更有效地表现盐度对仿刺参蛋白摄入的影响，结果见图1。由图1可以看出，养殖水体的盐度对仿刺参蛋白摄入量有显著的影响（P<0.05），在盐度为2.2%～3.1%范围内，随着盐度的升高，仿刺参对蛋白的表观消化率升高，对蛋白的摄入量增加；在盐度为3.1%～3.4%范围内，随盐度的升高，仿刺参对蛋白的表观消化率下降，即对蛋白的摄入量下降；盐度过低、过高对于仿刺参消化吸收蛋白质均有较大影响。

2.2 盐度对蛋白酶活力的影响

由图2可以看出，养殖水体盐度对仿刺参肠道内在的蛋白酶活力具有显著影响（P<0.05），在盐度为2.2%～3.1%范围内，随着盐度的升高，仿刺参消化道内蛋白酶活力逐渐提高；当盐度大于3.1%后，随着盐度的升高，仿刺参消化道内蛋白酶活力下降，盐度过高或过低都会对酶的活力具有抑制作用。

3 小结与讨论

本研究中仿刺参摄入蛋白利用率与其内在蛋白酶的活性存在高度的相关性，盐度通过影响其内部消化道内酶的活性，来调节仿刺参对蛋白质的消化吸收。在盐度3.1%时，仿刺参蛋白酶活力最高，对蛋白的消化吸收能力最强。盐度是反映水中无机离子含量的指标，水生动物对环境的适应一般围绕其等渗点进行渗透压调节，而渗透压调节是一需要耗费能量的生理过程[3]，导致刺参生长发育受到影响[1]。盐度在3.1%时，可能处在刺参等渗点的附近，刺参用于渗透压调节的能量较少，故生长得快，吸收蛋白质的能力及肠道内蛋白酶活性最高。本研究中最适盐度3.1%是刺参生长的最适盐度，与王国利等[4]的研究结果一致。

蛋白质是水产动物发育过程重要的营养物质，水产动物的生长速度与其所摄食饲料的粗蛋白含量有密切关系，而消化酶活性的研究有助于更准确地掌握水产动物对饲料中蛋白质的需求量[8]。仿刺参体内存在多种蛋白酶，其活性不但随着季节、水温的变化而有显著的变化[9，10]，而且受盐度的影响也非常明显，盐度是反映水中无机离子含量的指标，有研究报道，无机离子直接影响酶的产生可能是盐度影响消化酶活性的主要原因之一[11]。本研究结果表明，盐度对仿刺参消化道内蛋白酶活力及蛋白质的消化率具有显著影响（P<0.05），其最适盐度为3.1%。

参考文献：

[1] 袁秀堂，杨红生，周 毅，等.盐度对刺参（Apostichopus japonicus）呼吸和排泄的影响[J].海洋与湖沼，2006，37（4）：348-354.

[2] CHEN J X.Present Status and Prospects of Sea Cucumber Industry in China.In：Advances in Sea Cucumber Aquaculture and Management[R].FAO，Rome，Italy，2004.

[3] 陈 勇，高 峰，刘国山，等.温度、盐度和光照周期对刺参生长及行为的影响[J].水产学报，2007，31（5）：687-691.

[4] 王国利，祝文兴，李兆智，等.温度与盐度对刺参（Apostichopus japonicus）生长的影响[J].山东科学，2007，20（3）：6-9.

[5] 王吉桥，张筱墀，姜玉声，等.盐度骤降对幼仿刺参生长、免疫指标及呼吸树组织结构的影响[J].大连水产学院学报，2009，24（5）：387-392.

[6] 王孝平，邢树礼.考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究[J].天津化工，2009，23（3）：40-41.

[7] LOWRY O H，ROSEBROUGH N J，FARR A L，等.福林酚试剂法测定蛋白质[J].食品与药品，2011，13（3）：147-151.

[8] 吴永恒，王秋月，冯政夫，等.饲料粗蛋白含量对刺参消化酶及消化道结构的影响[J].海洋科学，2012，36（1）：36-41.

[9] 付雪艳.海参（Apostichopus japonicus）消化蛋白酶的初步研究[D].山东青岛：中国海洋大学，2004.

[10] 王吉桥，唐 黎，许 重，等.仿刺参消化道的组织学及其4种消化酶活性的周年变化[J].水产科学，2007，26（9）：481-484.

[11] 陈品健，王重刚，郑森林.盐度影响真鲷幼鱼消化酶活力的研究[J].厦门大学学报（自然科学版），1998，35（7）：754-755.