植物组织总RNA提取方法的研究进展

摘 要:RNA是植物分子生物学研究的前提和基础,植物RNA的提取有多种不同方法,每种方法的分离原理以及应用范围有一定的差异,对不同RNA提取方法优缺点以及适应性进行了综述,以便从不同的植物材料中获得高质量的RNA。论述了RNA提取中的常见问题,进行了RNA纯度和完整性的分析并作出了相应总结。

关键词:植物组织;RNA;提取

中图分类号:Q942文献标识码:A 文章编号:1005-569X(2010)03-0029-03

1 引 言

RNA是一种重要的遗传信息分子,细胞中的RNA可以分为mRNA、tRNA、rRNA三大类,这三大类都存在于细胞质中。因此,植物总RNA提取的实质就是裂解细胞,释放出RNA,并去除蛋白和DNA等杂质,最终获得高纯产物的过程。

总RNA是植物分子生物学研究的基础,在基因cDNA克隆、基因体外翻译、cDNA文库构建、cDNA末端快速扩增(Rapid amplificathion of cDNA ends, RACE)、差异显示反转录PCR(Diferential display reverse transcription-PCR, DDRT-PCR)、抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)等研究时均需要高质量的RNA(裴东、谷瑞升,2002)。所以,对不同植物材料中RNA提取方法的改进一直为研究人员所重视。

提取植物RNA有很多方法,目前应用较多的有CTAB法、SDS法、异硫氰酸胍法(张志刚等,2006)、热硼酸盐法(李宏、王新力,1999)以及商业试剂盒Trizol等。由于不同植物、不同植物的不同部位都有其各自的生理结构特点,因此没有一种方法是适用于所有的植物组织,不能用一成不变的操作去提取不同植物材料的RNA,而必须在熟悉RNA提取基本原理及要点的情况下,根据各种方法自身的特点,对提取方法进行筛选和适当的改进,获得一种对目的材料高效的RNA提取方法(卢圣栋,1999)。

2 RNA常见的提取方法

2.1 异硫氰酸胍法

异硫氰酸胍是强烈的蛋白质变性剂,它不仅能强烈抑制RNA酶的活性,还能有效的解离核蛋白与核酸的复合体,与加入的β-巯基乙醇和N-月桂酰基氨钠(Sarkosy1)共同对RNA产生强烈的抑制作用。这种方法的优点在于有强烈的蛋白质变性剂,它能强烈的抑制植物材料及缓冲液中的RNA酶的活性(望飞勇,何勇等,2004)。

2.2 CTAB法

该法以CTAB为变性剂,利用较高浓度的CTAB不仅能对植物细胞有较好的裂解作用,而且还能有效地分离核蛋白与核酸的复合物,同时沉淀总核酸,然后再选择性地分离出RNA。CTAB法是核酸提取的常用方法,它不仅适于植物总RNA的大量提取,而且也适于DNA的提取(程水源等,2005)。

2.3 热硼酸法及改良热硼酸法

热硼酸法(黄凤兰等,2005)在提取过程中经强烈振荡和温浴,能提高RNA的产量。该技术将硼酸缓冲体系、蛋白酶化合物依靠氢键形成复合物,二硫苏糖醇(DDT)作为还原剂,聚乙烯吡咯烷酮(PVP)可与多酚化合物形成复合体,它们都可以抑制植物组织中酚类物质与RNA的结合的氧化以及酚类物质的氧化(WANG和VODKIN,1994),通过Li+沉淀剩余的酚类物质,从而与RNA分开。因此,该技术非常适于富含酚类物质的植物组织中总RNA的提取。

2.4 苯酚法

苯酚法(顾红雅等,1995)是通过苯酚、氨基水杨酸和三异丙基萘硫酸盐共同抑制RNA,使蛋白与核酸分离,经氯仿、苯酚抽提纯化,用3mol/L 醋酸钠来沉淀总RNA。

2.5 阴离子去污剂法

去污剂法(卢圣栋,1993)的去污剂多用SDS,主要作用是使核蛋白与核酸复合物分离,并与β-巯基乙醇、苯酚等共同抑制RNA酶的活性,使蛋白质变性,最后经氯仿、苯酚抽提纯化,用3mol/L 醋酸钠来沉淀RNA。

2.6 LiCl-尿素法

LiCl-尿素法(姚红艳等,2003)是用LiCl选择性地沉淀RNA,用高浓度的尿素,抑制RNA并分离核蛋白与核酸。该方法简单、试剂低廉,但有时会存在DNA污染、丢失一些小分子量的RNA(如5SRNA)以及Li+和Cl-的残留等问题,可能会干扰mRNA的反转录和体外翻译。

2.7 Trizol试剂快速提取法

Trizol试剂快速提取法特点是快速、高效,用高浓度的异硫氰胍破碎细胞,使RNA酶失活,并沉淀蛋白,乙醇沉淀核酸,DNA酶消化残留的DNA,去除杂质,并将RNA吸附到硅化膜上,用DEPC-水溶液洗脱膜上的RNA即可。

2.8 改良的Gomez法

改良的Gomez法(Lpez和Lim,1992)加入巯基基乙醇做还原剂,避免酚类物质的氧化。利用SDS对蛋白进行变性,多糖通过高浓度的K+和乙醇来沉淀,LiCl专一沉淀RNA时也可将部分多糖留在上清液中。

2.9 CsCl超离提取法

CsCl 超离提取法(欧阳浩鑫等,2004)利用梯度沉降提取植物总RNA,优点是提取方法简单,提取RNA量大。

2.10 植物组织总RNA提取试剂盒

许多公司根据科研需要,研制出一些提取RNA用的试剂或试剂盒,可根据需要进行选择。使用试剂盒提取植物组织总RNA的优点是提取速度快、用时短,RNA产量和质量高;但往往价格很贵、一次提取量少。

3 RNA提取中的常见问题

3.1 酯类物质、多糖和蛋白质的影响

(1)酚类物质的干扰。一般用如Li+、Ca2+等沉淀、离心、苯酚/氯仿抽取等方法去除,但它只能去除未被氧化的酚类物质,因此在提取总RNA的初始阶段要注意防止酚类被氧化。抑制酚类被氧化的方法一般有:a. 还原剂法:一般在提取缓冲液中加入β-疏基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)等还原剂,能有效抑制酚类物质的氧化;b. 螯合剂法:采用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)与酚类化合物形成螯合物,使之不能成为多酚氧化酶的底物而抑制它们的氧化,并可在以后的抽提过程中除去这些螯合物;c. 此外还有牛血清白蛋白法(BSA)、Tris一硼酸法、丙酮法均可抑制酚类化合物的氧化。

(2)多糖的干扰。多糖在植物组织中含量丰富,用盐酸胍处理可以除去一些多糖,用LiCl沉淀可将部分多糖留在上清液中,用低浓度的乙醇可沉淀多糖(SU 和Gibor,1998),也可用醋酸钾沉淀多糖。Fang等(1992)认为缓冲液中高浓度的NaCl或加入一定浓度的2-丁氧乙醇也有助于除去多糖。

(3)蛋白质的干扰。在提取缓冲液中加入蛋白质变性剂,如异硫氢酸胍、盐酸胍、硫基乙醇、苯酚、SDS、CTAB等可去除大部分蛋白质,也可以利用蛋白酶K降解蛋白杂质,最后再用苯酚/氯仿抽取去残存的蛋白质。

(4)次级代谢产物的干扰。在植物组织中次级代谢产物很容易与RNA结合并被共同抽提出来,从而阻碍RNA的分离。因不能确定这些次级代谢产物是什么物质,所以,目前还没特别好的方法来解决这问题。一般用选择性沉淀和梯度离心等方法来纯化。

3.2 外源物质的污染。

(1)研钵、玻璃制品、塑料制品和电泳槽的污染。

(2)研究人员造成的污染。

(3)实验所配制溶液的污染。

3.3 内源物质的污染

植物细胞破碎后细胞内源RNA酶会降解mRNA。对于内源RNA酶的污染可以从三个方面着手加以解决:一是选用恰当的提取方法,尽量缩短提取时间;二是加入适量的RNA酶抑制剂可有效地抑制RNA酶的活性;三是所有的操作尽量在低温下进行,可降低RNA的活性。

4 RNA纯度和完整性的分析

最常用的检测方法是使用紫外分光光度计检测RNA样品OD260和OD280的值,通过计算它们的比值判断总RNA的纯度和含量,如OD260/OD280在1.8~2.0范围内,则说明所提取的RNA没有明显降解。也可以通过甲醛变性凝胶电泳检测,根据分离条带的完整性和亮度估计其纯度和含量,如果含有比较完整的28S rRNA和18S rRNA条带,且28S rRNA条带的亮度大约是18S rRNA条带亮度的2倍,则说明获得的总RNA质量较好。这种方法相对简单,但灵敏度低,利用溴化乙锭法染色至少需要200ng的RNA。但如果用SYBR、GOLD SYBR和GoldViewna II染色,则能检测到1 ng和2 ng的总RNA,极大提高了灵敏度。

5 结 语

高质量的RNA是进行基因克隆,基因表达研究等的前提。但由RNA很容易被RNA酶降解,而且RNA酶广泛存在而且不易变性失活,因此,RNA提取过程中控制RNA酶的活性是极为关键的。在植物RNA提取的不同方法中,CTAB法成本低廉,且能有效地去除样品中的蛋白质、多糖、多酚等物质,提取的RNA完整性好,纯度高,但是步骤繁琐,耗费时间较长。快速SDS法提取的RNA中可能含有微量Li+和Cl- ,它们会干扰RNA的反转录和体外翻译,可向RNA溶液中加入0.1 倍体积3mol/ L 醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇沉淀,12 000 r/min 离心5min,75 %的乙醇洗涤沉淀1次,用适量DEPC处理的水溶解进行进一步纯化(Zhang和Clarke,2001)。Trizol一步提取法快速、简捷,所需试剂种类少,提取的RNA纯度高、完整性好,结合高盐沉淀法可从多糖多酚含量高的样品中获取高质量的RNA;但Trizol试剂价格比较贵,多应用于小量样品的提取,所得的RNA数量比较有限,不适合对RNA需求量大的研究(望飞勇,2004)。

参考文献:

[1] 顾红雅,翟礼嘉,明小天,等.植物基因与分子操作[M].北京:北京大学出版社,1995.77~83.

[2] 黄凤兰,李长海,孙婷婷,等.芍药花瓣总RNA的提取[J].生物技术通报,2005,3(4):282~283.

[3] 李宏,王新力.植物组织RNA提取的难点及对策[J].生物技术通报,1999(1):36~39.

[4] 卢圣栋.现代分子生物学实验技术(第2版)[M].北京:中国协和医科大学出版社,1999.147~148.

[5] 卢圣栋.现代分子生物学实验技术[M].北京:高等教育出版社,1993.135~149.

[6] 欧阳浩鑫,夏桂先,刘祥林.仙鹤藓RNA提取不同方法比较[J].首都师范大学学报,2004,25(2):57~60.

[7] 裴东,谷瑞升.几种提取木本植物中RNA方法的比较和改进[J].植物生理学通讯,2002,38(4):362~365.

[8] 望飞勇,何勇,许本波,等.长江大学学报(自然版)农学卷[J].2004,1(4):111~113.

[9] 姚红艳、赵双宜、夏光敏.改良尿素—氯化锂方法提取成熟小麦种子总RNA[J].中国生物工程杂志,2003(4):86~88.

[10] 张志刚,李栒,官春云,等.改良提取水稻胚乳和拟南芥花柱中DNA和RNA的SDS法[J].植物生理学通讯,2006,42(3):493~495.

[11] Fang G,Hammar S, Grumet R. A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA[J]. Biofeedback. 1992, 13: 52~54.

[12] Lpez Gmez R,Lim MA. A method for extracting RNA with modified Gomez method[J].hortscience, 1992, 27: 440~442.

[13] SU X,Gibor A. A method for RNA istation from macroalgae[J].Anal biochem, 1998,(174): 650~657.

[14] WANG C S, VODKIN L O. Extraction of RNA from tissues containing high level of procyanidins that bind RNA[J].Plant mol bio rep, 1994, (12): 132~145.

[15] Zhang C M,Clarke P R. Roles of Ran GTP and Ran GDP in precursor vesicle recruitment and fusion during nuclear envelope assembly in a human cell-free system[J].J curr biol, 2001, 11: 208~212.