产广谱细菌素芽孢菌筛选与鉴定

材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品。

土壤分别来自江苏南京、江苏连云港、湖北恩施、贵州遵义、安徽六安的农耕地;南京市玄武湖湖泥;南京上海路市售泡白菜、泡萝卜。

1.1.2 培养基。

LB固体培养基、LB液体培养基、NA固体培养基;PDA马铃薯葡萄糖琼脂培养基、高氏一号培养基[11]。

1.1.3 指示菌。

微生物菌种均由食品系微生物实验室提供。以革兰氏阴性菌代表菌大肠杆菌、革兰氏阳性菌代表菌金黄色葡萄球菌作为抑菌性鉴定指示菌，其余作为抑菌谱测定的指示菌。

1.1.4 主要仪器与设备。

CJ-2S超净工作台（天津市泰斯特仪器有限公司）;

HVE-50高压灭菌锅（南京博惠科学仪器有限公司）;

HPX-9082 ME数显恒温培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）;

TH2-C恒温摇床（太仓市实验设备厂）;

TH4-200倒置荧光显微镜（南京奥力科学仪器有限公司）;

AUY200电子分析天平（日本ShiMADzu）;

PHS-3C精密pH计（上海三信仪表厂）;

DK-8D电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）;

GL-ZZM高速冷冻离心机（赛特湘怡离心仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌种分离与筛选。

取1 g样品放入10 mL无菌水中充分混匀，80 ℃加热30 min杀死营养细胞，制成1∶10的样品匀液。然后用无菌水按10倍梯度稀释5个梯度浓度，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，每个梯度浓度吸取0.1 mL于LB固体培养基均匀涂布后置于37 ℃的培养箱中培养24 h。初步根据菌落形态判断不同的菌株，分别挑取不同的菌株进行划线纯化，划线3～4次得到纯种的菌株。

1.2.2 抑菌试验。

细菌的抑菌性测定采用抑菌圈法，以抑菌圈直径判断其抑菌性的大小。

挑取纯种菌株接种到5 mL 的LB液体培养基中，置于37 ℃摇床培养18 h后作为种子液，将种子液按2%的接种量接种到50 mL液体培养基中37 ℃摇床培养18～22 h，取适量发酵液置于4 ℃、10 000 r/min的离心机中离心15 min去除细菌细胞，得到细菌的发酵上清液，取0.1 mL大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均匀涂布在NA固体培养基作为指示菌，用打孔器在每个培养基上打出3个孔，然后注入适量的发酵上清液，不宜溢出。置于37 ℃培养箱培养6～8 h后观察有无抑菌圈并测量抑菌圈直径[12-13]（抑菌圈直径包括打孔器直径，打孔器直径为8 mm）。

1.2.3 细菌素检验。

取发酵上清液测量其pH，将酸性发酵上清调至碱性以排除有机酸的影响，做抑菌试验观察其抑菌圈大小变化。然后进行酶解试验，先取适量发酵上清液测量其pH，按1 mg/mL的比例分别加入蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶，调节pH到相应酶的最适pH（分别为7.4、6、7.4和2.0）后37 ℃水浴反应1 h，调回原液的pH后做抑菌试验，观察其抑菌圈大小变化[14]。

1.2.4 菌种鉴定。

对菌株进行革兰氏染色和芽孢染色[15]，观察其颜色反应。将初步确定为芽孢菌的菌株送往菌种鉴定机构——生工生物工程（上海）股份有限公司进行16SrDNA测序鉴定其具体的菌属。

1.2.5 抑菌谱测定。

将各种指示菌培养至对数期作为抑菌试验的指示菌，取J11的发酵上清液进行抑菌试验，测定其对各种指示菌的抑菌圈大小，得到J11的抑菌谱。

2 结果与分析

2.1 产细菌素菌株的筛选结果

通过细菌的分离纯化，从10种样品中分离筛选出48株纯种菌株，对该48株纯种菌株进行抑菌试验，获得16株具有一定抑菌性的菌株，表1为该16株菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径。其中J11、W1、Plb3、PC12这4株菌抑菌性较好，抑菌圈直径在15 mm以上。

2.2 抑菌物质细菌素鉴定结果

为排除有机酸对微生物的抑菌作用，对抑菌性较好的J11、W1、Plb3、PC12进行排除有机酸试验，测得其发酵上清液的pH都大于7，呈碱性，可以有效排除有机酸的影响。对其发酵上清液进行酶解试验，酶解试验结果如表2所示，J11被胰蛋白酶、胃蛋白酶酶解，W1、PC12能被蛋白酶K酶解， Plb3能被胰蛋白酶酶解。由此可确定J11、W1、Plb3、Plb3的抑菌物质是肽类物质细菌素。

2.3 菌種鉴定结果

对抑菌最好的J11菌株进行菌种鉴定，革兰氏染色呈阳性，芽孢染色可以看到绿色芽孢以及细菌形态呈杆状，可以初步确认其为芽孢杆菌，PCR扩增J11的16SrDNA基因序列为1 494 bp，将J11的16SrDNA 基因序列碱基序列进行 Blastn和数据库中16SrDNA 序列进行核苷酸同源性比较，发现其与Paenibacilluspolymyxa IAM 13419 16SrDNA和PaenibacilluspolymyxaHBUAS57026 16SrDNA的序列相似率为99%。取上述序列和Paenibacillus thiaminolyticus、Paenibacillus kobensis、Bacillus cytotoxicus、Bacillus subtilis、Paenibacillus dauci、Paenibacillus massiliensis、Paenibacillus lautus、Paenibacillus hemerocallicola模式菌株的 16SrDNA 进行系统发育分析，构建了J11的系统发育进化树，结果如图1所示，确认J11为多粘类芽孢杆菌[16-18]。

2.4 抑菌谱测定结果

选择16种指示菌进行抑菌试验，得到J11的发酵上清液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、溶酪巨型球菌、戊糖片球菌、瑞士乳酸杆菌、乳酸链球菌都有抑菌效果，抑菌圈直径如表3所示，其中对溶酪巨型球菌的抑菌性最敏感，抑菌圈直径达30.13 mm。J11抑菌效果见图2。

3 结论

从湖泥中筛选出一株具有广谱抑菌效果的新菌株J11，通过对J11的发酵上清液进行排除有机酸和酶解试验，确定其抑菌物质为细菌素。对其进行革兰氏染色和芽孢染色以及16SrDNA测序，鉴定其为多粘芽孢杆菌。并测得其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、溶酪巨型球菌、戊糖片球菌、瑞士乳酸杆菌、乳酸链球菌都有抑菌效果，具有广谱的抑菌性，且抑菌性良好，可抑制食品常见的腐败菌和致病菌，在食品防腐保鲜中有一定的使用价值。

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