害螨胁迫对富士苹果叶片细胞超微结构及游离脯氨酸含量的影响

材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试树网室内的盆栽苹果树，品种为短枝富士，树龄3年。

1.1.2供试螨山楂叶螨、二斑叶螨和苹果全爪螨均采自山东省泰安市郊区苹果园。然后连续饲养于室内盆栽海棠苗上，养虫室条件为温度（26±1）℃，相对湿度（60±10）%，光周期12 L∶12 D。

1.2试验方法

1.2.1细胞超微结构观察选择健康盆栽苹果苗，按10头/叶的螨口密度分别将上述3种害螨的雌成螨接到不同植株的成熟叶片上，在叶柄处涂抹凡士林防止螨逃逸，每种害螨接2株树，重复3次，空白对照不接螨。

接螨6 d时，分别剪取处理叶片及对照叶片。在叶片叶螨刺吸点处切取0.5 mm2小块，迅速置于4%戊二醛溶液中进行固定。用注射器抽气3次，固定后用pH值为7.2的磷酸盐缓冲液漂洗，然后用1%锇酸固定，再用乙醇-丙醇梯度脱水。之后用Epon 812环氧树脂渗透包埋，使用LKB-5型超薄切片机切片，醋酸铀-柠檬酸铅双重染色，置于JEM-1200EX型透射电镜下观察细胞超微结构并拍照。

1.2.2游离脯氨酸含量测定分别将山楂叶螨雌成螨按10、20、30 头/叶3个螨口密度接到不同植株的成熟叶片上，每处理4株，重复3次，叶柄处涂抹凡士林防止螨逃逸。以不接螨处理做空白对照。分别在为害6、8、10 d时摘取各处理叶片，于-24℃低温保存。

酸性茚三酮试剂：称取茚三酮2.5 g，加入冰乙酸60 mL和6 mol/L磷酸40 mL，于70℃加热溶解，冷却后储于棕色试剂瓶中，冰箱内4℃保存。

称取10 mg脯氨酸溶于少量80%乙醇溶液内，蒸馏水定容至100 mL，浓度为100 μg/mL。分别吸取0、0.5、1.25、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0 mL放入50 mL容量瓶内，蒸馏水定容，配成0、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 μg/mL标准液。分别吸取各标准液2 mL、冰乙酸2 mL、茚三酮试剂2 mL放入10 mL带塞刻度试管内，在沸水中放置15 min，取出后于520 nm光波处测定吸光值。以脯氨酸浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

称取苹果叶片0.3 g，剪碎，加入适量80%乙醇液和少量石英砂研磨成浆，转移至10 mL带塞刻度试管内，用80%乙醇液洗涤残渣，定容至10 mL，80℃水浴提取20 min。提取液中加入1勺人造沸石和适量活性炭，强烈振荡5 min以去除干扰的氨基酸，过滤。

按照标准曲线测定方法对试样进行测定，每处理重复测定3次，利用标准曲线和游离脯氨酸含量计算公式计算游离脯氨酸含量，用Duncan’s新复极差检验法进行差异显著性分析。

脯氨酸含量（μg/gFW）=X×VFW

式中，X为根据标准线算得的样品浓度值（μg/mL），V为样品液总体积（mL），FW为样品鲜重（g）。

2结果与分析

2.1苹果叶片细胞超微结构变化

2.1.1正常叶片的细胞学特征正常苹果叶片表皮和叶肉细胞呈长方形，大小相近，细胞排列整齐，细胞质中细胞器分布有序，细胞间隙明显。细胞内叶绿体数量较多，呈船形，紧贴细胞壁分布。细胞核呈长椭圆形，核仁和核膜清晰可见。细胞膜和细胞壁完整，相邻细胞壁界限明显（图1）。

2.1.2山楂叶螨为害叶片的细胞学特征山楂叶螨刺吸为害苹果叶片6 d，叶肉细胞严重变形，细胞间隙变大，细胞器散乱于细胞质内，细胞内容物溢出，有些细胞仅在细胞壁周围残存一些碎屑，几乎成为空胞（图2A、E）。叶绿体内出现淀粉粒，肿胀趋于圆球状，甚至叶绿体膜消失，叶绿体溶解散乱在细胞质中（图2A、B）。细胞核被其他细胞器挤压变形，细胞膜逐渐消失，细胞核解体（图2C）。细胞壁分解断裂，相邻细胞壁界限逐渐模糊，最终消失形成空胞（图2B、C、D、E），甚至紧邻栅栏组织的上表皮细胞壁也分解断裂（图2D），有些细胞壁上附着针状结晶沉淀物（图2F）。

2.1.3二斑叶螨为害叶片的细胞学特征二斑叶螨为害6 d，苹果叶片细胞受到不同程度破坏，细胞质减少，细胞间隙增大，叶绿体缩短膨胀变形，叶绿体中可见大量淀粉粒存在，细胞核核膜界限不清（图3A），受害严重的细胞几乎完全被破坏，细胞器降解甚至消失，细胞壁溶解断裂，弯曲变形，细胞器残渣外溢到细胞间隙内（图3A、B、C）。

2.1.4苹果全爪螨为害叶片的细胞学特征苹果全爪螨为害6 d，苹果叶肉细胞内部结构发生巨大变化，叶绿体由长椭圆形变为近圆形，其内有淀粉粒沉积，受害严重的细胞结构几乎完全被破坏，细胞器只剩残渣或消失，只剩细胞壁残余框架（图4A）。细胞壁界限趋于模糊，细胞器残余物从细胞壁缺口处溢出细胞（图4B、C）。

2.2叶片内游离脯氨酸含量变化

2.2.1游离脯氨酸标准曲线经过Microsoft Excel分析确定，脯氨酸标准回归方程为Y=0.0365X-0.0237，R2=0.9964。其中Y为520 nm的吸光值，X为脯氨酸浓度（μg/mL）。

2.2.2山楂叶螨为害对苹果叶片游离脯氨酸含量的影响从表1可知，与对照叶片相比，在山楂叶螨为害期内，苹果叶片中的游离脯氨酸含量发生明显变化。为害6 d时，受害叶片内游离脯氨酸含量随螨口密度的增加而上升，显著高于对照的游离脯氨酸含量。但为害8、10 d时，脯氨酸含量随螨口密度的增加而降低。

山楂叶螨螨口密度较低时（10 头/叶），叶片中游离脯氨酸含量随为害时间延长持续升高，为害10 d的含量最高，是对照叶片含量的1.79倍。随着螨口密度的增加，游离脯氨酸含量随为害时间延长下降，为害8、10 d时，30 头/叶含量低于对照叶片。

3讨论与结论

叶螨为害可对植物产生诸多影响，如叶绿素含量[15，16]，糖类和矿物质元素含量[15，17，18]，蛋白质、氨基酸含量[9，17]，抗氧化酶活性[9，19]，蛋白酶抑制剂活性[20，21]，光合作用、蒸腾作用[15，22，23]等变化明显，同时，叶片细胞超微结构也会发生显著变化[3，8]。叶绿体是植物完成光合作用的场所，其结构完整是保证光合作用正常进行的前提，而其对逆境胁迫比较敏感[24，25]。本研究结果表明，富士苹果叶片叶肉细胞对3种害螨胁迫反应敏感的细胞器均为叶绿体，受害后的叶绿体形状发生改变，排列趋于混乱，内部结构被损坏。相关研究发现，叶绿体是植物细胞中产生活性氧的重要场所之一[26]。在害螨胁迫下，植物会产生过多活性氧，造成细胞水平的氧伤害，叶绿体、线粒体等细胞器功能损害，DNA等其他生物大分子降解和失活，最终诱发细胞过敏性坏死[19，27]。

植物细胞内的淀粉粒由光合作用产生，其运输一般以蔗糖-Pi形式进行[28]。随着害螨对叶肉细胞膜系统的破坏，光合作用产物输送受阻，导致在叶绿体中积累大量淀粉粒。本研究在对山楂叶螨为害的富士苹果叶片细胞进行超微结构观察时，发现针状结晶沉淀物，该类物质可能在抵抗山楂叶螨刺吸胁迫中具有重要作用，是富士苹果对山楂叶螨为害防卫机制的一种表现形式。

游离脯氨酸作为植物体内重要的渗透调节物质之一，其含量高低与植物抗逆能力有关[29]。叶片中的游离脯氨酸含量与其相对含水量呈明显负相关[30]，其含量的增加是引起渗透势下降的一个关键因素，有助于细胞或组织保持水分，维持蛋白质、膜和亚细胞结构的稳定。汤章城[31]和Hare等[32]研究显示，逆境下植物体内游离脯氨酸含量往往会升高。山楂叶螨为害初期，苹果叶片细胞没有受到严重破坏，会通过产生游离脯氨酸对抗叶螨，故叶片内的游离脯氨酸含量上升，这也说明苹果叶片能够通过游离脯氨酸的累积避免细胞受到渗透胁迫的伤害。随着山楂叶螨数量增加和为害程度加重，当超过苹果叶片所承受的范围时，苹果叶片渗透调节机制失效，游离脯氨酸含量下降，甚至低于对照。

本研究只做了3种苹果害螨在10 头/叶下为害6 d对富士苹果叶片细胞超微结构的影响，不同为害时间及不同苹果品种在不同叶螨为害下的细胞超微结构变化情况仍待进一步研究。前人研究发现脯氨酸能够参与植物叶绿素合成[31]，其含量的变化是否有利于苹果叶片通过光合作用对螨害进行营养补偿值得进一步研究。

参考文献：

[1]洪晓月. 农业螨类学[M]. 北京：中国农业出版社，2012： 223-229.

[2]张正斌. 植物对环境胁迫整体抗逆性研究若干问题[J]. 西北农业学报， 2000， 9（3）： 112-116.

[3]段灿星， 彭高松， 朱振东， 等. 抗感水稻品种受灰飞虱为害后叶片活性氧及超微结构的变化[J]. 华北农学报， 2011， 26（6）： 207-211.

[4]段灿星， 余娇娇， 李万昌， 等. 灰飞虱胁迫对水稻叶片中防御酶活性及细胞超微结构的影响[J]. 植物生理学报， 2012， 48（10）： 971-978.

[5]兰景华. 梨网蝽对梨叶细胞结构影响的机制[J]. 西南农业大学学报， 1994， 16（1）： 17-19.

[6]兰景华. 桔始叶螨对桔叶叶绿体危害的超微变化简报[J]. 西南农业大学学报， 1989， 11（4）： 346-348.

[7]兰景华. 朱砂叶螨对棉叶细胞超微结构的影响[J]. 西南农业大学学报， 1992， 14（6）： 528-530.

[8]代庆阳，苏学辉. 桑始叶螨对桑叶细胞超微结构的影响[J]. 四川师范学院学报（自然科学版）， 2002， 23（3）：265-267.

[9]黎志辉， 鲁亚. 二斑叶螨对菜豆叶片几种生理指标的影响[J]. 安徽农业科学， 2011， 39（13）： 7683-7684.

[10]吴娟， 李琳一， 许翔， 等. 番茄刺皮瘿螨对番茄叶片生理指标的影响[J]. 园艺学报， 2006， 33（6）： 1215-1218.

[11]窦彩虹. 梨树瘿螨的发生及螨瘿病生理的研究[D].兰州： 甘肃农业大学， 2011.

[12]陈应武， 窦彩虹， 张新虎， 等. 苹果梨叶片几种生理生化指标对梨上瘿螨为害的响应[J]. 中国科学院研究生院学报， 2006， 23（4）： 509-513.

[13]杨明丽， 付卫东， 张国良， 等. 太行刺皮瘿螨（Aculops taihangensis Hong & Xue）对臭椿生长及生理生化指标的影响[J]. 山东农业大学学报（自然科学版）， 2009， 40（4）： 585-592.

[14]张瑾， 徐秉良， 吴步梅. 梅下毛瘿螨为害对杏树幼芽结构和生理的影响[J]. 园艺学报， 2014， 41（4）： 653-660.

[15]Sivritepe N， Kumral N A， Erturk U， et al. Responses of grapevines to two-spotted spider mite mediated biotic stress[J]. Journal of Biological Sciences， 2009， 9（4）： 311-318.

[16]Park Y L， Lee J H. Leaf cell and tissue damage of cucumber caused by twospotted spider mite （Acari： Tetranychidae） [J]. Journal of Economic Entomology， 2002， 95（5）： 952-957.

[17]Tomczyk A. Remove from marked records physiological and biochemical responses of plants to spider mite feeding[C]//Halliday R B， Walter D E， Proctor H C， et al. Acarology： proceedings of the 10th International Congress. Melbourne： CSIRO Publishing， 2001： 306-313.

[18]孙月华， 郅军锐， 田甜. 二斑叶螨为害对菜豆生理指标的影响[J]. 生态学杂志， 2014， 33（4）： 1010-1014.

[19]贾贞， 宋占午， 金祖荫， 等. 山楂叶螨危害对海棠叶片POD的影响[J]. 西北植物学报， 2004， 24（11）： 2136-2139.

[20]Kant M R， Ament K， Sabelis M W， et al. Differential timing of spider mite-induced direct and indirect defenses in tomato plants[J]. Plant Physiology， 2004， 135（1）： 483-495.

[21]Santamaria M E， Cambra I， Martinez M， et al. Gene pyramiding of peptidase inhibitors enhances plant resistance to the spider mite Tetranychus urticae[J]. PLoS One， 2012， 7（8）： e43011.

[22]Sances F V， Wyman J A， Ting I P. Morphological responses of strawberry leaves to infestations of two spotted spider mite[J]. Journal of Economic Entomology， 1979，72（5）：710-713.

[23]Sances F V， Wyman J A， Ting I P. Physiological responses to spider mite infestation on strawberries[J]. Environmental Entomology， 1979b， 8（4）： 711-714.

[24]任丽花， 黄敏敏， 江枝和， 等. 干旱胁迫对圆叶决明叶片超微结构的影响[J]. 中国草地学报， 2008， 30（1）： 30-34.

[25]孟凡娟， 庞洪影， 王建中， 等. NaCl和Na2SO4胁迫下两种刺槐叶肉细胞叶绿体超微结构[J]. 生态学报， 2011，31（3）： 734-741.

[26]Asada K. The role of ascorbate peroxidase and monodehydroascorbate reductase in H2O2 scavenging in plant[M]//Scandalios J G. Oxidative stress and the molecular biology of antioxidant defenses. NY： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1997：715-735.

[27]董海丽， 井金学. 活性氧和一氧化氮在植物抗病反应中的作用[J]. 西北农林科技大学学报（自然科学版），2003， 31（1）： 161-166.

[28]夏叔芳， 于新建， 张振清. 叶片光合产物输出的抑制与淀粉和蔗糖的积累[J]. 植物生理学报， 1981， 7（2）： 135-142.

[29]陈应武， 窦彩虹， 张新虎， 等. 梨瘿螨的为害对梨叶片几种生理生化指标的影响[J]. 兰州大学学报（自然科学版），2004， 40（4）： 68-71.

[30]陈玉惠， 叶建仁， 魏初奖， 等. 松材线虫侵染对马尾松、黑松水分及其相关代谢的影响[J]. 植物病理学报， 2005， 35（3）： 201-207.

[31]汤章城. 逆境条件下植物脯氨酸的累积及其可能的意义[J]. 植物生理学通讯， 1984（1）： 15-21.

[32]Hare P D， Cress W A， Van Staden J. Proline synthesis and degradation： a model system for elucidating stress-related signal transduction[J]. Journal of Experimental Botany， 1999， 50（333）： 413-434.