园林废弃物中高效降解菌的分离与鉴定

摘 要：为了更好地对园林废弃物进行资源化利用，试验以堆肥腐熟后的园林废弃物作为供试材料，进行其菌株的分離和鉴定。通过细菌16S rDNA测序分析，鉴定出21株细菌，分属于3门5纲7目10科13种，其中，厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）分别鉴定出4种、6种和3种；通过真菌rDNA ITS 测序分析，鉴定出9株真菌，分属于1门（子囊菌门）2纲2目2科3属5种，其中青霉菌属（Penicillium）鉴定出3种，曲霉属（Aspergillus）和短梗霉属（Aureobasidium）各鉴定出1种。

关键词：园林废弃物；菌株；分离；鉴定

中图分类号：S961.6 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.10.001

Abstract： In order to make better use of garden wastes， the experiment was conducted to isolate and identify the strains from the garden wastes composting. According to the bacterial 16S rDNA sequencing analysis， 21 bacteria strains were identified， which were belonged to 3 phyla， 5 classes， 7 orders， 10 families and 13 species. Among the three phyla， the bacteria of Firmicutes， Proteobacteria， Actinobacteria were identified 4 species， 6 species， and 3 species， respectively. According to fungal rDNA ITS sequencing analysis， 9 fungi strains were identified， which were belonged to 1 phylum （Ascomycota）， 2 classes， 2 orders， 2 families， 3 genuses， 5 species. Among the three genuses， the fungi of Penicillium， Aspergillus， and Aureobasidium were identified 3 species， 1 species， and 1 species， respectively.

Key words： garden waste； strains； isolation； identification

随着城市绿化建设的飞速发展以及人们对生态环境要求的提高，园林废弃物的数量快速增加，焚烧、填埋、粉碎粗回收等非资源化的处理方式既带来了严重的环境问题[1]，同时也造成了资源的浪费。大多数园林废弃物含有丰富的有机质，部分地区通过堆肥使其形成基质重新应用于园林和城市绿化，对土壤有很好的改良作用，是一种变废为宝的科学手段，一方面降低了对自然环境的污染，另一方面也节约了资源，是一种适合可持续发展的处置方式。

目前，处理园林废弃物堆肥的主要模式是参照农业废弃物的堆肥方式，然而，相较于一般的农业废弃物，园林废弃物中有更加丰富的、难以降解的木质纤维素，主要存在于植物细胞壁的微管组织中，纤维素分子链聚集成的微纤丝相互交织镶嵌排列形成结晶相和非结晶相，该结构具有超强的防御作用，化学试剂难以有效接触纤维素表面[2]，降解速率低，严重阻碍以园林废弃物为原料的堆肥处理进程。

芽孢杆菌、诺卡氏菌、高温放线菌、黑曲霉、青霉等微生物均具有木质纤维素降解能力[3]，可提高木质纤维素降解速率，因此，高效降解纤维素的微生物菌株筛选对园林废弃物高效资源化利用意义重大。

试验对腐熟的园林废弃物进行微生物分离实验以及分子生物学鉴定，获得园林废弃物腐熟过程中的细菌和真菌信息，旨在为具有纤维素降解能力的菌株筛选提供基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

腐熟材料是不同植物枝叶的混合物，取自常州新北区园林绿化服务处。

1.2 试验仪器

高压灭菌锅（MLS-3780）、人工气候箱（韶关市泰宏医疗器械有限公司生产）、电子天平（梅特勒-托利多EL303）、恒温培养振荡器（ZD-810，上海精宏实验设备有限公司生产）、pH计（梅特勒-托利多S220）、高速台式离心机（TDL-8-AC，上海安亭科学仪器厂生产）、超净试验台（SW-CJ-1F，苏州尚田洁净技术有限公司生产）。

1.3 培养基及配置

1.3.1 改良高氏1号培养基（培养真菌） 葡萄糖10.0 g·L-1，蛋白胨5.0 g·L-1，硝酸钾 1.0 g·L-1，磷酸氢二钾0.5 g·L-1，硫酸镁 0.5 g·L-1，氯化钠 0.5 g·L-1，硫酸亚铁0.01 g·L-1，去离子水1 000 mL，pH值调至7.2，添加琼脂粉15.0 ～20.0 g·L-1。

1.3.2 牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌） 牛肉膏5.0 g·L-1，蛋白胨10.0 g·L-1，氯化钠5.0 g·L-1，去离子水1 000 mL，pH值调至7.2，添加琼脂粉15 ～20 g·L-1。

1.3.3 牛肉膏蛋白胨液体培养基（培养细菌） 牛肉膏5.0 g·L-1，蛋白胨10.0 g·L-1，NaCl 5.0 g·L-1，去离子水1 000 mL，pH值调至7.2。

1.3.4 马铃薯培养基 马铃薯200.0 g·L-1，葡萄糖20.0 g·L-1，琼脂15.0 ～20.0 g·L-1，去离子水1 000 mL，pH值调至7.2。

1.4 试验方法

1.4.1 微生物分离纯化 在无菌条件下称量1.0 g园林废弃物腐熟材料样品，装入无菌三角瓶中，加入99 mL无菌水，密封后置于培养振荡器（200 r·min-1、25 ℃）振荡20 min，对混匀的样品进行梯度稀释，配制成1×10-2，1×10-3，……1×10-8不同浓度梯度的稀释液。

微生物分离纯化试验在苏州大学植物栽培与生理实验室进行。使用移液枪吸取各浓度梯度的园林废弃物稀释液100 μL，在牛肉膏蛋白胨培养基和改良高氏1号培养基上均匀涂布，进行细菌以及真菌分离，每个浓度园林废弃物稀释液平行凃板3个。细菌于31 ℃培养24～48 h，观察各梯度平板中菌落数量及分布情况，挑选出优势菌落分布较均匀的平板，根据菌落形态特征各异分别挑取单菌落，划线接种于新的牛肉膏蛋白胨培养基上，将纯化2～3次后的菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在31 ℃ 200 r·min-1振荡12～24 h；吸取0.7 mL菌液注入菌种保存管内，再加入0.7 mL已灭菌的80%甘油，摇晃使其混匀，置于-70 ℃冷冻保存。真菌平板于28 ℃倒置培养72 h，观察各梯度平板中菌落数量及分布情况，筛出优势菌落数量分布均匀的梯度平板，将不同形态特征的微生物菌落依次分离单接种到新的改良高氏1号培养基上纯化2～3次，将分离几次后的微生物菌株在28 ℃下培养3 d，后置于4 ℃冰箱保藏。

1.4.2 菌株鉴定 （1）细菌和真菌基因组DNA提取。取液体培养基内容物5 mL，12 000 r·min-1离心1 min，清除上清液；加入细胞悬浮液500 μL，置于37 ℃温水浴中1 h，期间相隔几分钟混匀1次；12 000 r·min-1离心2 min，清除上清液；加入225 μL缓冲液A，使菌体与缓冲液混合均匀；再加入10 μL蛋白酶K，振荡使其混匀；加入裂解缓冲液S 25 μL，振荡使其混匀；57 ℃水浴放置20 min，其间颠倒混匀1～2次；加入缓冲液B 250 μL，颠倒混匀；加入乙醇250 μL，混匀，瞬时离心以去除管盖内壁的水珠；把离心管中所有物质加入吸附柱内，12 000 r·min-1离心30 s，倒弃废液，将吸附柱放入收集管中；取缓冲液 C 500 μL添加到吸附柱内，12 000 r·min-1离心30 s，倒弃废液，将吸附柱放入收集管中；将700 μL漂洗液W2添加到吸附柱内，12 000 r·min-1离心30 s，倒弃废液，将吸附柱放入收集管中；将500 μL漂洗液W2添加到吸附柱内，12 000 r·min-1离心30 s，倒弃废液，将吸附柱放入收集管中；将吸附柱放回收集管中；12 000 r·min-1离心2 min；将吸附柱置于一个新的1.5 mL离心管中，去除残存的漂洗液；将吸附柱放回收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100～200 μL洗脱缓冲液TE，室温放置2～5 min，12 000 r·min-1离心2 min，将溶液收集到离心管中；所提取DNA稀释20倍作为PCR模板，剩余菌液加入等体积甘油放-80 ℃保存。

（2）细菌16S rDNA及真菌rDNA ITS基因克隆。PCR反应体系：9.5 μL焦碳酸二乙酯水，上下游引物各1 μL，1 μL模板DNA，Taqmix 12.5 μL。

PCR的反应条件：在98 ℃条件下预变性3 min，然后98 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min；在4 ℃条件下保存。

细菌16S rDNA基因克隆选用引物对：27F 5"-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3"，1492R 5"-GGTTACCTTGTTACGACTT-3"；真菌rDNA ITS基因克隆选用引物对：ITS1 5"-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3"，ITS4 5"-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3"。

（3）細菌16S rDNA及真菌rDNA ITS序列分析。 在PCR结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，将含有预期片段大小的PCR产物送到苏州木芮生物科技有限公司检测。用Contig Express软件对双向测序完成的产物序列进行拼接，通过 NCBI数据库的BLAST工具进行在线检索，对序列进行同源性分析，通过其相似度和覆盖度进行真菌和细菌的种属鉴定。

2 结果与分析

2.1 优势菌落的分离

通过对不同稀释梯度平板中的微生物菌落进行观察，结果发现，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5的园林废弃物稀释液平板中微生物菌落数量多且分布杂乱，菌落交叉生长，难以区分单菌落；1×10-6，1×10-7，1×10-8的稀释液平板中微生物数量及种类分布较为均匀，菌落独立不重叠，且所出现的菌落种类在各梯度均有生长。因此，真菌和细菌的分离从1×10-6，1×10-7，1×10-8的稀释液平板中挑选进行涂板培养。

取马铃薯葡萄糖培养基平板10个，每个平板十字型划分为4块，分别编号Z1-20，X1-20。按照浓度梯度，从1×10-6，1×10-7，1×10-8的菌落平板中选取适宜菌落，用接种环蘸取菌落划于马铃薯培养基对应标记区域，将培养出的菌株用于后续细菌和真菌菌株的DNA序列分析。

2.2 细菌菌株DNA序列分析

2.2.1 细菌菌株16S rDNA序列克隆 从图1可以看出，在预期的1 500 bp附近检测出阳性条带，说明大部分细菌16S rDNA序列克隆成功。2.2.2 细菌菌株DNA序列比对结果及种类分布 通过对细菌序列进行拼接后利用BLAST在线比对其同源性，结果如表1和表2所示，分离获得测序正确21个样品，其相似性均≥97%，覆盖率均≥98%，鉴定出3门5纲7目10科13种细菌。其中，厚壁菌门（Firmicutes）共鉴定出4种细菌，分属于芽孢杆菌属（Bacillus）和解硫胺素芽孢杆菌属（Aneurinibacillus），分别鉴定出1种和3种细菌；变形菌门（Proteobacteria）共鉴定出6种细菌，分属于短波单胞菌属（Brevundimonas）、苍白杆菌属（Ochrobactrum）、草螺菌属（Herbaspirillum）、近伯克氏菌属（Paraburkholderia）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、沙雷氏菌属（Serratia）；放线菌门（Actinobacteria）鉴定出3种细菌，分属于谷氨酸菌属（Glutamicibacter）、微杆菌属（Microbacterium）、原小单孢菌属（Promicromonospora）。21个样品中，米氏硫胺素芽孢杆菌（A.migulanus）最多，有4个，其次草螺菌（H. sp.）和嗜麦芽寡养单胞菌（S. maltophilia）分别有3个，解硫胺素芽孢杆菌（Aneurinibacillus sp.）有2个，其他种均只有1个。

2.3 真菌菌株DNA序列分析

2.3.1 真菌菌株rDNA ITS序列克隆 由图2可知，在预期的750 bp附近能检测出阳性条带，说明真菌rDNA ITS 序列克隆成功。

2.3.2 真菌菌株rDNA ITS序列比对结果及真菌种类分布 真菌rDNA ITS 测序及比对结果通过对真菌序列进行拼接后利用 BLAST 在线比对其同源性，结果如表3和表4，共测序正确9个样本，其相似性和覆盖率均为100%，鉴定出1门（子囊菌门）2纲2科3属5种真菌。其中，青霉菌属（Penicillium）中有3种，曲霉属（Aspergillus）和短梗霉属（Aureobasidium）各1种。9个样本中，青霉菌（P. sp.）和出芽短梗霉（A. pullulans）出现的样本数最多，分别有3个，产黄青霉（A. fumigatus）、桔青霉菌（P. citrinum）和萨氏曲霉（A. sydowii）均只有1个样本。

3 结论与讨论

园林废弃物中有大量纤维素的存在，自然条件下纤维素中通过缔合氢键形成致密结构，其外包裹纤维素和半纤维素，很难降解[1]。利用园林废弃物堆制有机肥的过程中，堆肥微生物主要有细菌群落和真菌群落，菌株群落利用园林废弃物中的有机物质代谢，加快堆制有机肥腐熟的进程[5]。园林废弃物堆肥材料中，细菌是数量最大、分布最广的微生物类群，不仅能够快速利用水溶性单糖类物质，还具有分解木质纤维素的能力，因此，其生物活性在堆腐过程至关重要[6]。芽孢杆菌属细菌是常见的优势细菌[7]，本研究中也从园林废弃物堆肥材料中分离和鉴定出1种芽孢杆菌属（Bacillus）细菌和3种解硫胺素芽孢杆菌属（Aneurinibacillus）细菌，芽孢杆菌的生长适温为50～70 ℃，堆肥高温阶段大量芽孢杆菌可增强对某些难降解有机物的分解，提高堆肥效率[8]。本试验还分离和鉴定出3种放线菌门（Actinobacteria）细菌，堆肥过程中放线菌具有溶解木质素，分解纤维素的能力[5]，其中，原小单孢菌（P. thailandica）也是堆肥体系中的优势菌群。本试验中通过真菌 rDNA ITS 测序分析发现，9 株真菌分属于2纲2目2科3属5种。其中，青霉属（Penicillium）的真菌最多，堆体内有机物以木质素、纤维素为主，该属可以分泌大量纤维素酶来有效分解纤维素进行利用，其他属的真菌也均有一定的抗逆及纤维素降解能力，如曲霉属（Aspergillus）[1]，该属的菌丝能够散布在园林废弃物堆肥材料内，通过分泌胞外酶来降解纤维素等有机物[11]。

本试验仅从园林废弃物堆肥材料中初步分离和鉴定出了部分堆肥体系细菌和真菌种类，而不同菌株特性及其降解纤维素和木质素能力大小，还有待进一步研究。

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