家禽胚蛋注射技术的应用研究(综述)1

摘  要：雏鸡出壳时要面对多种应激因素，此时机体的免疫状况对它的存活和抗病能力有重要的影响。众多研究表明，胚蛋注射（又称“卵内注射”）疫苗可以高效率、低成本和有效地诱导入孵种蛋的胚胎产生免疫应答反应，从而增强雏鸡出壳后抗感染的能力。本文将介绍当前胚蛋注射不同疫苗的应用和研究情况。

关键词：胚蛋注射;疫苗;家禽

中图分类号：S815 文献标志码：C 文章编号：1001-0769（2020）01-0003-04

1  马立克氏病

Sharma和Burmester通过一项基本的实验室试验率先向认为胚蛋注射疫苗可以用于保护家禽免遭马立克氏病（Marek"s Disease，MD）的侵害。此后胚蛋免疫也被用于预防家禽的传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease，IBDV）、新城疫（Newcastle Disease，ND）和禽流感（Avian Influenza，AI），并且已经在全球发展成标准的商业惯例。Sharma和Burmester报道，在孵化的第18天给入孵种蛋的胚胎接种可免疫火鸡疱疹病毒（Herpesvirus of Turkey，HVT） FC126毒株的疫苗，出壳后3 d再向雏鸡腹腔注射致病性MD病毒，由此产生的抵抗力比在出雏后1 d经颈后皮下接种疫苗的雏鸡要强许多。用长2.54 cm的配置22-G针头的注射器给入孵种蛋的胚胎接种0.1 mL HVT，整根针头需通过入孵种蛋的大头或长轴中间的小孔插入。当从入孵种蛋侧边注射时，接种物分别以55%、25%和20%的比例注射到胚体、羊水和卵黄囊中;当从入孵种蛋的大头注射时，接种物分别以11%、89%和0的比例注射到胚体、羊水和卵黄囊中。虽然胚蛋注射不会影响入孵种蛋的孵化率，但能够使雏鸡从出雏到8周龄一直处于病毒血症状态。此外，与出壳后接种的雏鸡相比，孵化期接种的雏鸡具有更高的可复活病毒滴度。因此，我们认为出壳前的接种不仅可以保护雏鸡避免随后发生自然感染传染性病毒病，而且疫苗毒株最少只需要6 d就能给雏鸡提供最大的保护力。

Sharma等開展了类似的后续研究，结果证实在入孵种蛋孵化第18天给胚胎接种Ⅰ型和Ⅱ型MD毒株以及HVT可以明显提高雏鸡的免疫力。具体来说，胚蛋接种而不是出雏时接种能对在3日龄时用MD强毒株攻毒的雏鸡提供更好的保护;在孵化第18天给胚胎接种HVT能使病毒在胚胎组织中快速增殖，尤其是能提高病毒在肺部的增殖速度。Wakenell等在2002年开展了一项新研究，即采用人工方法，用配置18-G针头的注射器给胚蛋接种HVT/SB-1疫苗，结果表明，要想使雏鸡获得最佳的生产性能，用胚蛋注射法接种MD疫苗时，疫苗必须注入无特定病原体（Specific-Pathogen-Free，SPF）鸡或肉用鸡入孵种蛋胚胎的羊膜或胚体的适当部位。

在最近的多项研究中，Peebles等证明，在孵化第18天向胚胎的羊膜或胚体自动化注射50 μL MD疫苗，无论雏鸡在入舍前是否经历了4 h或8 h的等待时间，罗斯708肉鸡出壳后的早期质量均未受到影响。Peebles等还证明，相同的疫苗接种法不会加剧4 h～18 h的入舍等待时间对雏鸡出壳后48 d内的生长性能的影响。

2  传染性法氏囊病

Giambrone等最早研究胚蛋注射法接种3种半成品IBD疫苗对日常保护鸡免遭IBDV标准抗原变异株攻毒的安全性和效力。该疫苗用长2.54 cm的配置21-G针头的注射器从入孵种蛋的气室人工注入孵化第18天的SPF鸡或肉用鸡入孵种蛋胚胎。雏鸡在3周龄通过滴鼻或点眼途径接受平均剂量为103 PFU的IBDV强毒株的攻毒。结果发现，虽然所有疫苗均会使1～3周龄雏鸡的法氏囊出现严重的显微病变，但是它们对IBDV标准毒株的最低保护率达到87%，对IBDV强毒株的最低保护率为60%。三种疫苗中的任何一种以充足剂量进行胚蛋接种均会提高胚胎和3周龄雏鸡的死亡率，而接种半剂量的疫苗对上述两种死亡率均无不利影响。因此，在进行胚蛋接种时，稀释使用IBD和MD半剂量商用疫苗能避免雏鸡发生免疫抑制反应和死亡。

此外，在随后同样使用SPF鸡和肉雏鸡进行的一项研究中，Moura等测试了重组减毒疫苗对IBDV攻毒后的家禽的保护情况。结果发现，在孵化第18天给胚胎接种2.3×103 PFU或5.6×103 PFU的疫苗，可以对2种雏鸡产生保护作用，使它们在2周龄时被IBDV STC毒株攻毒后免于死亡，同时法氏囊免受损伤。此外，2种剂量能够让SPF鸡和肉雏鸡产生高水平的抗体，且不会影响入孵种蛋的孵化率和雏鸡出雏后第1周的存活率。然而，接种更低剂量的疫苗会对SPF雏鸡产生充分的保护作用，要想使肉雏鸡产生充分的免疫力则需要接种更高剂量的疫苗。虽然注射的途径和胚蛋的目标组织区域并未被确定，但是，我们可以假设疫苗是通过入孵种蛋的大头人工注射入羊膜内的。

3  新城疫

Stone等在孵化第18天利用胚蛋注射法给白洛克鸡和白来杭鸡的入孵种蛋接种剂量和抗原浓度各不相同的新城疫油乳剂灭活苗，以此评估疫苗剂量和抗原浓度对种蛋孵化率和雏鸡免疫力的影响。试验使用配置16-G针头或22-G针头的注射器，疫苗被注入入孵种蛋小头下深3.81 cm处，以便使疫苗能够沉积在胚胎皮下的卵黄中或体腔内。在雏鸡出壳2周时首次测定血清血凝抑制效价，结果发现，雏鸡的血清转化率介于27%～100%，胚蛋接种能改善雏鸡在53日龄时感染新城疫病毒嗜内脏型强毒株后的发病率和死亡率。用配置18-G针头、20-G针头或22-G针头的注射器注射100 μL疫苗对白洛克鸡和白来杭鸡的入孵种蛋孵化率无显著影响。Stone等得出的结论是，如果新城疫疫苗含有充足水平的抗原并接种得当，那么胚蛋接种可产生有效的保护性免疫力以及令人满意的血清转化率和孵化率。

4  禽流感

Stone等还评估了白洛克鸡和白来杭鸡的入孵种蛋在孵化第18天接种禽流感油乳剂灭活苗后的孵化率和出壳雏鸡免疫力受影响情况。Stone等采用与新城疫疫苗相同的接种流程。同样，血清血凝抑制滴度首次测定时间是雏鸡为2周龄时。结果发现，雏鸡血清转化率介于85%～100%，胚蛋接种能改善雏鸡在34日龄时用高致病性禽流感病毒攻毒后的发病率和死亡率。至于新城疫疫苗，Stone等发现，白洛克鸡和白来杭鸡的入孵种蛋胚胎用配置18-G针头、20-G针头或22-G针头的注射器注射    100 μL疫苗后，它们的孵化率均未受到显著的影响。Stone等推断，如果禽流感疫苗像新城疫疫苗一样含有充足水平的禽流感病毒抗原并且接种得当，那么胚蛋接种会使雏鸡产生有效的保护性免疫力以及令人满意的血清转化率和孵化率。

5  球虫病

Sokale等利用商用多蛋注射机给孵化第18.5天的罗斯708肉鸡的入孵种蛋接种50 μL含有堆形艾美球虫（Eimeria acervulina）、巨型艾美尓球虫（Eimeria maxima）和柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）卵囊的球虫疫苗——Inovocox EM1疫苗（硕腾公司生产，美国密歇根州喀拉马索市）。结果表明，入孵种蛋的孵化率和孵化第21.5天胚胎重（Body Weight，BW）均未受到显著的影响。然而，当接种剂量中84.8%和15.3%的疫苗分别被注入入孵种蛋的胚胎中或羊膜内，雏鸡在出壳后第4天开始排出体内的球虫卵（注射后第6天），并持续到第13天，排卵高峰出现在第7天（注射后第10天）。尽管注射Inovocox EM1疫苗肯定会使胚胎出现疫苗诱导型感染，但对肉用种鸡的入孵种蛋胚胎发育或初生雏鸡的质量没有不良影响。该研究结果表明，在孵化第18.0天至第18.8天之间给入孵种蛋的胚胎注射Inovocox EM1疫苗可以安全且有效地提前刺激雏鸡的免疫系统，使其产生免疫力以抵抗随后的球虫感染。

随后，Sokale等开展了一项配套研究，探討Inovocox EM1疫苗对罗斯708肉鸡的雏鸡出壳后14 d生长性能的影响情况。试验设计与早先研究所用的相同，但是本次试验检测了雏鸡的死亡率、采食量、增重和饲料转化率。结果发现，稀释液组和疫苗组的雏鸡在所有生长性能指标上均无显著差异。然而，稀释液组雏鸡和疫苗组雏鸡在14日龄的BW、7～14日龄的采食量和增重以及0～14日龄采食量上均显著高于未注射的对照组雏鸡。因此，这些后续结果证实，在孵化第18.0天至第18.8天给罗斯708肉鸡的入孵种蛋接种Inovocox EM1疫苗是安全的，因为它不仅不影响种蛋的胚胎发育和出壳雏鸡的质量，而且也不影响雏鸡出壳后14 d的总体生长性能。

Sokale等在2018年进一步测定了给入孵种蛋的胚胎注射Inovocox EM1疫苗对新生雏鸡多项指标以及对罗斯708肉鸡35日龄生产性能的影响情况。按免疫剂量的1倍或10倍接种疫苗不会影响入孵种蛋的孵化率和雏鸡出壳时的绝对体重，但是接种10倍剂量的疫苗会降低雏鸡出壳体重占种蛋重的百分比，两种剂量均会降低雏鸡在21～28日龄以及0～35日龄时的增重，提高雏鸡21～28日龄时的饲料转化率（Feed Conversion Ratio，FCR），并提高雏鸡28日龄时肠道的相对重量。该研究获得的疫苗注射会对雏鸡14日龄后的生长性能产生不良影响的结果与Sokale等在2017年得到的雏鸡14日龄前的试验结果相反，但其最新的结果再次验证了先前的结果，并进一步建议接种1倍免疫剂量的Inovocox EM1疫苗可能更安全，并且可充分确保球虫卵完成生活史。

6  鸡败血支原体

鸡败血支原体F株是商业性蛋鸡行业用于预防蛋鸡感染鸡败血支原体野毒株的一种疫苗株。Elliott等在入孵种蛋孵化第18天向胚胎的羊膜中注射50 μL鸡败血支原体F株疫苗。棉拭子检测表明，后续孵出的雏鸡气管、口腔、食道、卵黄膜和十二指肠均感染了鸡败血支原体F株。根据这些发现和不同剂量对种蛋孵化率的影响，我们认为给蛋鸡的入孵种蛋胚胎接种低剂量（不高于120 CFU/剂）的鸡败血支原体F株在商业性食用蛋行业中有实际应用价值。

7  核苷酸疫苗

Dalloul等研究了利用胚蛋注射法给白来杭鸡的入孵种蛋胚胎注入胞嘧啶鸟嘌呤（Cytosine-phosphate-Guanine，CpG）寡脱氧核糖核苷酸对雏鸡的球虫易感性的影响。研究人员利用商业化多蛋注射系统在入孵种蛋孵化第18天向胚胎的羊膜腔中注入疫苗（溶于100 μL灭菌磷酸缓冲盐溶液中）。虽然胚蛋接种25 μg含有2种非甲基化CpG序列之一的寡脱氧核糖核苷酸不会显著影响雏鸡的增重，但是胚蛋注射能够减少雏鸡随后排放的球虫虫卵数，这证明其能够增强试验鸡抵抗堆形艾美耳球虫感染的能力。此外，当与     10 μg、33 μg或100 μg重组艾美耳球虫微粒子蛋白联合给药时，其中一种CpG寡脱氧核糖核苷酸的剂量达到25 μg时能够使雏鸡在感染柔嫩艾美耳球虫前产生最高的抗体应答反应，而且能够显著提高雏鸡的增重，降低雏鸡在感染堆型艾美耳球虫后的虫卵排泄量。这些研究人员得出的结论是，利用胚蛋注射法给药，CpG寡脱氧核糖核苷酸能够提高雏鸡的免疫力，并在雏鸡感染艾美耳球虫后发挥辅助性免疫作用。这些发现表明，无论是否与重组艾美耳球虫蛋白联用，用胚蛋注射法给入孵种蛋胚胎注射CpG寡脱氧核糖核苷酸在增加雏鸡对某些艾美耳球虫的抵抗力上具有潜在的商业应用价值。

原题名：In ovo applications in poultry： A review（英文）

原作者：E. D. Peebles （密西西比州立大学）