基于p38MAPK通路初探大黄黄芩配伍对内毒素血证模型大鼠肝脏炎症的调节机制

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[摘要]为了探究大黄黄芩药对对脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）诱导的内毒素血证模型大鼠肝脏炎症的调节机制，选取取雄性SD大鼠50只，随机分为空白组、模型组、地塞米松组、药对高剂量组、药对低剂量组，每组10只。各组大鼠给予相应药物进行预防性给药，连续给药7d。末次给药结束0.5h后尾静脉注射LPs（5 mg·kg^-1）造模，后每0.5h测定一次动物肛温并记录，于造模后4h处死动物，测定脾脏胸腺系数；采用ELISA法检测肝组织中细胞因子白介素、肿瘤坏死因子-a（TNF-a）的含量；采用比色法测定肝组织中一氧化氮（NO）含量；采用westem blot法检测肝组织中Toll樣受体蛋白4（Toll样受体-4），p38MAPK，磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）及一氧化氮合成酶（iN0s）蛋白相对表达量。结果显示，与空白组大鼠相比，模型组大鼠肝组织中TLR4蛋白表达、iN0s蛋白表达、p38磷酸化表达升高，IL-1，N0，TNF-a含量显著升高（P<0.05或P<0.01）。与模型组比较，药对高剂量能显著降低大鼠肝组织中IL-1，N0，TNF-a的表达（P<0.05或P<0.01），下调iNOS蛋白表达与p38磷酸化表达（P<0.05），但对TLR4蛋白并未出现显著的回调作用；药对低剂量能显著降低模型大鼠肝组织中IL-1，N0的表达（P<0.01），显著下调iNOS蛋白表达（P<0.01），对p38磷酸化表达具有一定的下调趋势但不具有统计学意义，而对TLR4蛋白表达并没有表现出一定降低作用。大黄黄芩配伍使用可能是通过减少p38蛋白的磷酸化表达从而阻断p38MAPK信号通路，来减少iN0s蛋白表达和炎性因子IL-1，NO，TNF-a的释放，从而达到减缓炎症反应保护机体组织的作用。

内毒素血症是革兰氏阴性细菌细胞壁中的脂多糖即内毒素进入血液循环引发的一系列病理生理改变的总称，许多严重疾病的病理过程中均伴随着内毒素血症，并成为许多危重症的重要致死原因。研究表明内毒素血症引起的炎症反应与组织器官严重损伤与多条炎症通路的激活有关，如核因子（nuclear factor，NF）-KB，Janus激酶/信号转导与转录激活子（Janus kinase signal transduction andtranscription activator，JAK-STAT）信号通路等。其中，p38MAPK信号通路是一条抗炎干预炎症性损伤的“经典”途径。内毒素（LPS）进入血液循环后，经TLR4受体蛋白识别将信号传人胞浆后激活p38MAPK通路导致p38蛋白磷酸化表达上升，进而导致转录因子活化，并最终导致iNOS蛋白以及炎症因子如TNF-a，IL-1，NO等的大量表达，造成机体损伤。而肝脏作为人体中的一个重要的代谢器官，在身体内起着去氧化、排毒等作用，在内毒素血症中肝脏通过血液循环代谢清除症产物对于炎症的缓解以及机体的保护起着至关重要的作用。然而肝脏作为代谢的主要场所也常常容易受到炎症介质的侵袭造成肝损伤，而肝脏的损伤又进一步导致机体代谢能力下降，最终导致炎症损伤进一步加重。

大黄.黄芩作为中药经典药对，古方多有记载，两者常常通过配伍使用从而达到增效作用来治疗热毒内盛的热毒证，现有资料已表明大黄、黄芩单味药对炎症有良好的缓解和治疗作用，然而对于传统中医中二者配伍使用的研究却鲜有出现。本实验拟通过建立内毒素大鼠模型，选取机体中重要的代谢器官肝脏作为主要研究对象，基于p38MAPK通路初步探究大黄黄芩配伍对炎症的调节机制，并通过对比目前研究现状揭示其与单味药使用作用机制与作用强度可能的差别。

1材料

1.1药物制备

大黄与黄芩药材购自北京本草方源药业有限公司，经成都中医药大学药学院严铸云教授鉴定分别为药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根和唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensjs Georgi.的干燥根。药对水提物制备：大黄黄芩药对配伍比例依据经典方剂三黄泻心汤，大黄黄芩配比为2：1。准确称取大黄30g、黄芩15g，加水约300mL，浸泡0.5h，用武火煎至沸腾后改用文火煎40min。倾出药液，加水约240mL再煎25min。合并药液浓缩至100mL，得0.45（生药）g·mL^-1，置4℃冰箱保存备用，于动物给药前以蒸馏水倍比稀释成1：0.5高、低2个不同剂量，即分别含生药0.45，0.225 g·mL^-1。阳性药物：地塞米松片用蒸馏水稀释成0.75 g·L^-1。

1.2动物

成年雄性SD大鼠，SPF级，体重（200±10）g，由四川成都达硕生物科技有限公司提供，实验动物生产许可证号SCXK（川）2013-24。饲养于成都中医药大学中医脏腑病症实验室动物房，动物使用许可证号SCXK（川）2012-179。

1.3试剂

LPS，Ecdi 055：B5（Sigma公司）；IL-1ELISA试剂盒（上海依科赛科技股份有限公司，批号141202）；TNF-a ELISA试剂盒（上海依科赛科技股份有限公司，批号141202）；NO试剂盒（南京建成）；BCA试剂盒（美国赛默飞科技有限公司，批号23227）；兔抗大鼠p-p38MAPK多克隆抗体，兔抗大鼠p38MAPK多克隆抗体，兔抗大鼠iNOS多克隆抗体（abcam公司）；兔抗大鼠TLR4多克隆抗体（CST公司）；兔抗大鼠GAPDH多克隆抗体（SAB公司）；FITC标记的山羊抗兔IgG抗体（北京中衫金桥公司）。

1.4仪器

PowerPAC200电泳仪（美国Bio-Rad公司）；Trans-Blot转膜仪（美国Bio-Rad公司）；Pharos FX荧光凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）；Varioskan全波长多功能酶标仪（Thermo Fisher Scientific）。

2方法

2.1动物分组及给药

成年雄性SD大鼠50只，适应性饲养1周后，依照体重与平均体温将大鼠均衡分为5组，每组10只，分别设为空白组、模型组、地塞米松组、药对高剂量组（相当于生药4.5 g·kg^-1）、药对低剂量组（相当于生药2.25 g·kg^-1）。各组动物经灌胃分别给予相应药物，每日早晚8：00各给药1次，给药体积为5 mg·kg^-1，连续给药7d，空白组和模型组给予等体积的纯水。

2.2模型制备及样本采集

实验前禁食不禁水8h，末次给药结束后，除空白组外各组大鼠经尾静脉注射LPS（5mg·kg^-1）造模，空白组使用等体积的生理盐水进行注射，全部操作均按无菌无热原要求控制。大鼠注射LPS4h后，使用20%乌拉坦（1.0g·kg^-1）麻醉，剖取大鼠肝臟、胸腺、脾脏，并迅速进行称重，采集组织迅速置于液氮中冷冻，然后转至一80℃保存，进而进行后续相关测试（课题组前期分别选取了2，4，6，8，10 h对内毒素血证模型大鼠肝组织炎性因子与TLR4-MAPK信号通路蛋白的变化进行动态研究，结果发现相关炎症指标与蛋白表达在LPS刺激造模后4 h表达升高显著，因此本次选择造模4 h后取样检测进行研究）。

2.3指标检测

2.3.1大鼠体温变化测定

于注射LPS造模结束后0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4 h分别测定动物肛温，分析各组动物的体温变化情况。

2.3.2脾、胸腺组织脏器系数的测定

称量并计算各组动物脾脏及胸腺的脏器系数：脏器系数=脏器质量（g）/体重（100g）。

2.3.3肝组织IL-1，TNF-a，NO细胞因子的测定

取肝组织用生理盐水制成10%匀浆，取上清，采用酶联免疫吸附法（Elisa）按照试剂盒上的要求测定肝组织中IL-1，TNF-a细胞因子的含量；采用比色法按照试剂盒上的要求测定肝组织中NO细胞因子的含量。

2.3.4肝脏TLR4，iNOS蛋白表达含量和p38总蛋白及磷酸化表达的测定

从-80℃冰箱中取出50mg肝组织，用PBS反复冲洗，弃去PBS冲洗液，向肝组织中加入含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和苯甲基磺酰氟（phenylmethane-sulfonyl fluoride，PMSF）的总蛋白裂液，于冰上进行组织匀浆，将匀浆液放入4℃离心机，15000r·min^-1离心10min，取上清液，少量用于BCA法测定蛋白浓度，其余按1：1与蛋白上样缓冲液混匀，在沸水中煮10min进行蛋白变性，于-80℃冰箱保存备用。依据BCA测定总蛋白结果对样本取样（按60μg的总蛋白取样），使用10%聚丙烯进行凝胶电泳，湿法电转移至PVDF膜，5%TBST室温封闭2 h后，加入1：1 000稀释的TLR4，p38MAPK，p-p38MAPK，iNOS抗体，4℃摇床过夜，洗膜后加入1：1万稀释的二抗，室温孵育2 h，最终用凝胶成像仪进行检测。Quantity One软件对检测图像进行分析，分析结束后使用0.1%NaOH漂洗，依照目的蛋白检测方法对内参（GAPDH）进行检测。以目的蛋白的吸光度（A）与对应GAPDH的A表示该样品的目的蛋白相对含量。

2.4统计学处理

统计学分析用SPSS13.0统计软件进行数据分析，数据采用x±s表示，组间比较采用方差齐性检验及单因素方差分析，根据方差齐性检验结果选择LSD（方差齐）或Tamhane"s（方差不齐）。

3结果

3.1造模后大鼠体温变化

LPS经尾静脉注射人大鼠体内后大鼠体温应激性升高，0.5～1.5h体温降低，1.5～4h体温不断升高，体温变化与文献表述保持一致。对比模型组，药对高、低剂量组能够一定程度的降低模型大鼠的体温1.5h后升高的现象，见图1。

3.2大鼠脏器系数的变化

对比空白组，模型组与药对高、低剂量组大鼠脾脏系数与胸腺系数均未出现明显变化，而地塞米松组大鼠脾脏系数与胸腺系数均显著降低（P<0.05），见表1。

3.3肝组织中炎症因子表达水平比较

对比空白组，模型组大鼠肝组织中IL-1，NO，TNF-a含量显著升高（P<0.01）；与模型组相比，药对高剂量组大鼠肝组织中IL-1，TNF-a，NO显著降低（P<0.05）；对比模型组，药对低剂量组大鼠肝组织IL-1，N0显著降低（P<0.05），TNF-a含量具有一定降低趋势，但无显著性差异，见表2。

3.4大鼠肝组织p38MAPK通路相关蛋白表达水平比较

对比空白组，模型组大鼠肝组织p38蛋白磷酸化表达显著升高，iNOS与TLR4蛋白表达明显上调（P<0.05）；对比模型组，药对高剂量组大鼠肝组织iNOS蛋白的表达与p38蛋白的磷酸显著降低（P<0.05），但TLR4受体蛋白表达仅表现出了一定的抑制趋势；对比模型组，药对低剂量组大鼠肝组织中iNOS蛋白表达明显降低（P<0.05），p38蛋白磷酸化表达表现出一定降低趋势，而TLR4受体蛋白的表达未表现降低的趋势，见图2～4。

4讨论

内毒素血症是由于大量细菌内毒素进入血液循环引起了体内一系列免疫反应，进而引发的一系列病理生理改变，目前对于内毒素血症的研究随着免疫应答通路研究的进展而不断的深入，逐渐从简单的症状研究转入对各种细胞通路动态变化过程的研究，其基本进程大致分成4个部分，即胞膜受体的识别、胞浆信号的传递、核内转录因子翻译以及最后炎症因子的释放。TLR4蛋白是细胞表面一类重要的受体蛋白，几乎分布于所有的细胞系中，它可以对不同病原相关分子模式进行识别、结合并引发下游一系列信号传导，是病原体的重要传感器，其参与了细胞增殖、分化、转化及凋亡的调节，并与炎症及其他多种疾病发展密切相关。LPS则是TLR4的最重要的配体，LPS与TLR4相结合后通过系列级联反应，启动TLR4介导的信号通路并向下传导。研究表明黄芩中的有效成分黄芩苷、汉黄芩苷，大黄中的有效成分大黄素等均能降低TLR4蛋白的表达，从而降低炎症介质的释放。TLR4被激活后通过髓样分化因子（myeloid differentiation factor88，MyD88）依赖反应通路，激活人肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumor necrosis factorreceptor-associated factor 6，TRAF-6），并与接头蛋白TAKl激活蛋白因子（TAKl.binding proteinl TABl）相结合，最终以转化生长因子激活性激酶1tivated kinase 1，TAK-1）为纽带激活胞浆内的p38MAPK通路。现代研究表明p38MAPK通路是MAPK家族控制炎症反应最重要的成员，能够促进白细胞的聚集和活化，调节转录因子的活性和细胞因子的合成，对炎症反应的调控起着关键性的作用。在受到TLR4通路诱导激活后，通过某种中间环节使MAPKKK激活，转而激活MAPKK；MAP.KK激活后再通过双位点磷酸化调控p38MAPK的活性导致p38蛋白发生磷酸化，转变为p-p38蛋白进而发生核转位，并调控下游蛋白激酶，激活炎症因子例如IL-1，TNF-a等的释放，从而造成机体组织损伤。因此通过阻断p38MAPK通路关键蛋白的激活与表达，进而阻断p38MAPK通路信号的传导，是减少炎症介质释放，治疗内毒素血症的重要途径之一。

古代并无内毒素血症的病名，但当代研究发现中医热毒证证型与内毒素血症初期症状相似。因此临床常使用具有泻火通腑作用的大黄与泻肺热解毒的黄芩这2个经典中药药对来配伍，用于内毒素血症初期的治疗。研究表明大黄、黄芩单味药物对于内毒素血症引起的炎症均有良好的治疗作用，同时数据指出当大黄黄芩配伍使用后其抗炎效果往往优于单味药物的使用。基于此课题组进一步深入探讨大黄黄芩配伍使用对于内毒素血症引起的肝脏炎症的调节机制。课题组首先通过造模对不同时间点模型大鼠肝组织TLR4，p38MAPK相关信号的动态变化进行研究，见图5～6，结果发现相关指标蛋白表达主要集中在造模4h后显著升高，因此確定了以4h为时间点作为后续研究的主要时间点。同时课题组前期对单味药物进行了相同分子水平的探究，结果显示，大黄黄芩单味药物对下游炎症因子IL-1，TNF-a，NO的释放均有一定的抑制趋势，其机制可能与减少调p38MAPK通路中关键蛋白p38蛋白磷酸化减少膜上受体蛋白TLR4表达有关，然而本实验结果则显示大黄黄芩配伍后对TLR4受体蛋白表达并未出现显著的抑制作用，这与单味药物的作用机制表现出了一定的差别。

综上所述，借助LPS诱导的大鼠内毒素血证模型，并基于p38MAPK蛋白通路，笔者阐明，大黄黄芩配伍使用能够降低模型大鼠肝组织中炎症介质IL-6，IL-1，TNF-a的释放，以及iNOS蛋白的表达，并且与p38磷酸化的抑制趋势相同，但与受体蛋白TLR4的抑制趋势并没有显著的相关性。提示大黄黄芩配伍使用对内毒素血证肝脏炎症的治疗机制可能是通过阻断胞浆内的p38MAPK通路来实现的，这与课题组前期单味药物的研究有所不同，配伍使用并不能对细胞膜上的受体蛋白TLR4蛋白起到一定的抑制作用，原因笔者认为其一可能与剂量有关，中药水提物中相关成分不能达到单一成分用药的浓度水平；其二可能与配伍后成分之间的相互反应与相互作用有关，导致相关成分溶出率与化学结构发生改变有关。然而关于大黄黄芩配伍使用后相对于单味药使用增效的机制与原因并没有得出，后续课题组将继续从单味药物与药对进行对比研究，观察相关指标变化，并结合前期课题组对单味药相关指标的研究，进一步探究大黄黄芩配伍的增效机制。与此同时通过对比主要免疫器官的脏器系数变化发现，大黄黄芩药对比西药在长期使用后毒性较小，对脏器损伤较轻，体现出中药在使用中低毒的特性。