miR-423-5p在小鼠急性肝衰竭模型中的功能研究

【摘 要】目的：探讨miR-423-5p在Con A诱导的小鼠急性肝衰竭模型中的功能。方法：制备Con A诱导的小鼠急性肝衰竭模型。RT-qPCR检测0 h， 6 h， 12 h， 24 h小鼠肝组织和血清中miR-423-5p 的表达情况，HE染色观察肝组织病理学改变，全自动生化分析仪检测血清 ALT和AST。结果：小鼠肝组织和血清miR-423-5p表达水平随着肝衰竭进程显著性升高。小鼠肝组织和血清miR-423-5p表达水平与肝细胞坏死率、血清ALT、AST水平呈显著性正相关。结论：miR-423-5p可能作为反映肝衰竭严重程度的分子标志物。

【关键词】microRNA;肝衰竭;分子标志物

中图分类号： R736.1 文献标识码： A 文章编号： 2095-2457（2019）17-0214-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.17.101

Studying the Function of MiR-423-5p in the Mouse Model of Acute Hepatic Failure Model

SONG Guang-zhong WAN Shuang-shuang ZHOU Qian HUA Yu-feng YANG Jun

（School of Laboratory Medicine， Hangzhou Medical College， Hangzhou Zhejiang 310053， China）

【Abstract】Aim： to study the function of miR-423-5p in the Con A-induced acute hepatic failure model in mice. Method： Liver failure in mice was established by intravenously injection with Con A. RT-qPCR was performed to detect the levels of hepatic and serum miR-423-5p of the mice exposed to Con A for 6 h， 12 h and 24 h. The hepatic histological morphological damage was detected with HE staining. Serum ALT and AST levels were determined using automatic analyzer. Result： The levels of hepatic and serum miR-423-5p increased significantly with the development of liver failure. The levels of hepatic and serum miR-423-5p had significant positive correlation with hepatic necrosis rate， serum ALT and AST. Conclusion： miR-423-5p may serve as a molecular biomarker for the acute liver failure.

【Key words】microRNA; Liver Failure; Biomarker

0 引言

肝衰竭系肝細胞大量死亡和肝功能严重破坏所致的临床症候群。肝衰竭多起病凶险，治疗难度高，预后较差。肝衰竭的发病机制复杂，是当今肝病学研究的热点。尾静脉注射刀豆蛋白A（Concanavalin A， Con A）能诱导小鼠产生急性肝损伤，是实验室常用的研究免疫介导的肝衰竭动物模型[1-3]。microRNA （miRNA） 作为一类独特的小分子非编码RNA，能够在转录后水平调控蛋白质的合成， 参与众多生理和病理过程。近年研究表明，miR-423-5p在心力衰竭、心肌梗死、胃癌等患者血浆或血清中表达水平升高，可能作为相关疾病的生物学标志物[4-6]。miR-423-5p在肝脏疾病进程中的功能及其作用机制研究较少， 本文就miR-423-5p在Con A诱导的小鼠急性肝衰竭模型中的功能作一探讨。

1 研究方法

1.1 Con A诱导的小鼠急性肝衰竭模型的建立

BALB/c小鼠经尾静脉注射Con A制备急性肝衰竭模型（注射剂量为20mg/kg体重，Con A用注射用生理盐水配制），正常对照组小鼠注射等量的生理盐水。于 0h，6h，12h，24h 摘眼球取血，处死小鼠取肝组织。所取小鼠血液室温静置30min后2000g离心10min，将上层血清转移至洁净的EP管，再12000g离心10min去除细胞沉淀，得到血清样品再分为两份：一份稀释 10 倍后用于小鼠血清 ALT和 AST检测（全自动生化分析仪）;另一份100μl用于总RNA的抽提和制备。肝组织标本也分为两份：一份肝组织标本用于常规固定、石蜡包埋、制备组织切片（用于常规苏木素-伊红（HE）染色）;另一份肝组织标本用于总RNA的抽提和制备。

1.2 肝组织HE染色

取0h，6h，12h，24h肝组织，立即置于10%福尔马林中固定，72h后，常规脱水，石蜡包埋，行3-5μm切片，进行HE染色，显微镜下观察肝脏组织的病理学改变并计算肝细胞坏死率。

1.3 小鼠肝组织和血清RNA抽提及纯化

小鼠肝组织总RNA（含小RNA）的提取按照Qiagen公司生产的miRNeasy Mini Kit说明书进行。基于mirVana PARIS试剂盒的使用说明并略作改动，从100 μl小鼠血清中提取总RNA。

1.4 RT-qPCR分析小鼠肝组织和血清miR-423-5p的表达水平

小鼠肝组织miR-423-5p表达水平的RT-qPCR分析参照TaqMan MicroRNA Assays试剂盒说明书，其中总RNA样品浓度为100ng/μl，U6 snRNA作为内参，数据分析采用2-ΔΔCt法。小鼠血清miR-423-5p表达水平的RT-qPCR分析也参照TaqMan MicroRNA Assays说明书，cel-miR-29作为外参，数据分析采用2-ΔΔCt法。

2 研究结果

2.1 Con A制备的小鼠急性肝衰竭模型

在Con A暴露 6 h后，在此阶段可见大量的炎性细胞浸润，存在小的散在的炎症坏死灶;在暴露12 h后，到处可见散乱的、片状肝组织坏死灶;在暴露24 h后，可见大量的融合性坏死灶。参照Hasselblatt等[7]方法根据坏死区域面积占肝组织总面积的百分比来计算坏死率。在6-24 h组，ALT、AST水平显著高于正常对照组（P<0.05），且呈现时间效应关系。

2.2 miR-423-5p表达水平和肝细胞坏死率等在小鼠急性肝衰竭模型中的相互关系

RT-qPCR证实小鼠肝组织和血清miR-423-5p表达水平随着肝衰竭的严重程度显著性增加，且呈现显著的时间效应关系。Spearman相关性分析表明：小鼠肝组织和血清miR-423-5p的表达水平与肝细胞坏死率、血清ALT、AST水平呈显著性正相关（见表1）。表明miR-423-5p可能作为反映肝衰竭严重程度的分子标志物。

3 讨论

肝衰竭是由病毒感染、酒精、药物、肝毒性物质等多种因素引起的严重而广泛的肝细胞死亡，导致肝脏本身合成、排泄、解毒、和生物转化等功能发生严重障碍，临床上主要表现为凝血机制障碍、黄疸、肝性脑病等。肝组织在短期内出现大块或亚大块坏死的分子机制尚不明了，临床上依然缺乏可早期预警疾病发生、监测疾病发展和严重程度的敏感、可靠、系统的有效指标，是肝衰竭难治性和不可预测性的根本原因。miRNA是一类长度约22个核苷酸的单链小分子非编码RNA， 可以稳定地存在于血清、血浆等体液循环中，并可能作为诊断肿瘤和其它疾病的非侵袭性生物标志物。has-miR-423基因位于人染色體17q11区，最早从人早幼粒白血病细胞系（HL-60）鉴定出来，其成熟序列包括has-miR-423-5p和has-miR-423-3p。

miR-423-5p在肝衰竭进程中起着怎样的功能和作用机制尚不明了。我们利用Con A制备的小鼠肝衰竭模型探讨了miR-423-5p表达水平与肝衰竭进程的相互关系，发现无论是肝组织还是血清中miR-423-5p表达水平都随着肝衰竭进程显著性增加，而且其表达水平与肝细胞坏死率、血清ALT、AST水平呈显著性正相关，提示miR-423-5p可能作为反映肝衰竭严重程度的又一新型分子标志物。另外需要指出的是，本文只是在Con A诱导的小鼠肝衰竭模型中探讨了miR-423-5p与肝衰竭进程的相互关系，初步研究结果提示miR-423-5p与肝衰竭进程关系密切，但差异表达的miR-423-5p在肝衰竭过程中的起着怎样的功能和作用机制仍值得进一步深入研究和开展。这对于深入阐明肝衰竭进程的分子调节机制，寻求早期预测、预防和治疗肝衰竭的新型分子靶标具有十分重要的意义。

【参考文献】

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