环介导恒温扩增技术快速检测大肠杆菌Ｏ１５７特异基因的建立

[摘要]目的建立环介导的恒温扩增快速检测大肠杆菌O157的方法。方法采用环介导的恒温扩增反应(LAMP)技术扩增大肠杆菌O157特异性基因，并与传统PCR比较。结果与传统的PCR技术相比，LAMP法更加简便快速、且在等温条件下进行，具有更高的灵敏性；特异性100%。结论该方法具有灵敏度高,特异性强,操作简便快速,不需要复杂仪器设备、为临床检测大肠杆菌O157提供了一个快速简便的新方法。

关键词：核酸 环介导等温扩增 大肠杆菌O157 检测

中图分类号：R446.139文献标识码：A文章编号：1672-5085（2007）7-0059-03

肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157患者在起病早期即可出现严重并发症，引起肝肾功能不全、凝血功能异常，出现全身炎症反应，甚至多器官功能衰竭；因此对其高效、准确的检测在预防和治疗肠出血性大肠杆菌O157患者中至关重要；近年来，病原体检测技术突飞猛进，日益成为诊断肠出血性大肠杆菌O157的有力工具，但目前的检测方法技术含量比较高，对操作要求、设备条件、工作环境均有较高的标准，仍不能进行广泛的普及和推广，特别是在医疗条件相对落后的地区更难以深入开展。更重要的是，由于大肠杆菌O157感染剂量极低,病程急,病情重,因此，筛检大肠杆菌O157的方法是否灵敏、特异及快速至关重要[1]。

环状介导的恒温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification of DNA, 简称LAMP）是核酸扩增的一种新方法，该方法在等温条件下能高特异性、高效、快速地扩增DNA。该方法操作简单易行，仅需要4条合适的引物、1 种DNA聚合酶、1个水浴箱或隔热装置即可进行。其终产物是一种混和物，由多个不同茎长的茎-环状结构的DNA 和在相同链中通过退火目的序列不断翻转复制而成的多样的环状结构所构成的花椰菜样结构所组成。 另外，检测产物的方法简单易行且选择性高。

1 材料和方法

1.1 菌株

肠出血性大肠杆菌O157菌株购于卫生部临检中心，金黄色葡萄球菌.痢疾志贺菌来源于省疾控中心，菌株接种营养琼脂斜面,37℃培养18h,转接3次后备用。

1.2 引物

由赛百盛公司合成，共2对。

内引物为：BIP：5´-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAATCATCGCACCGTCAA-3´，FIP：3´-TCATCGCACCGTCAAAGGAACCGTTACCGGGCAATAAGGAAC-5´；外引物为：B3：5´-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3´，F3：3´-GTGAAATTATCGCCACGTTCGG-5´

1.3 细菌DNA提取

将营养琼脂斜面上的细菌接种于营养肉汤, 37℃ 培养18h。采用文献[1]的酚氯仿法提取DNA;分别取2µL用于LAMP和PCR反应.

1.4 LAMP扩增

总体积为25µL的反应体系中包括2个内引物FIP和BIP 、2个外引物F3和B3 、4种dNTP、三甲铵乙内脂、Tris-Hcl (PH8.8) 、(NH4)2SO4、MgSO4、0.1%Triton X-100 和一定数量的双链靶DNA，将混和物在95℃加热 5 min 后置冰内冷却,然后加入8U的 Bst DNA聚合酶大片段(Gibco公司), 在65℃保温1h,随之加热至80℃持续10 min后完成反应.

1.5 PCR扩增

按照PCR试剂盒(TaKaRa)的说明,进行目的基因扩增。PCR条件为94℃ 5min；94℃ 50s, 57℃ 50s, 72℃ 50s进行30次循环；72℃ 5min。

1.6 LAMP和PCR产物电泳检测

分别取LAMP和PCR扩增产物8μL加2μL溴酚蓝混匀,以DNA Marker作相对分子质量指示,用1.0%琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/mL)在100V电压下电泳30min,置凝胶成像系统中进行结果分析。

2 结果

2.1 LAMP法与PCR法扩增敏感性比较

将7份大肠杆菌O157DNA经1/10~1/108倍梯度稀释,比较两者的敏感性后发现，在待测标本稀释到1/105时PCR法就难于进行准确的检测了，而LAMP法在标本稀释到1/108"时仍然能够获得较好的扩增结果。（表1）

2.2 LAMP法扩增的特异性

通过LAMP法检测大肠杆菌O157.金黄色葡萄球菌和痢疾志贺菌发现，LAMP法特异性高(100%)，未发现假阳性出现。

3 讨论

肠出血性大肠杆菌O157感染性腹泻,是近年来新发现的危害严重的肠道传染病。该病可引起腹泻、出血性肠炎、继发溶血性尿毒综合症(HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)等[1]。HUS和TTP的病情凶险,病死率高。自1982年美国首次发现该病以来,在世界上许多国家相继发生了暴发和流行,尤其1996年5～8月间日本发生了由大肠杆菌O157引起的人类历史上规模最大的一次暴发流行,累计患者近万人并有数人死亡,引起了世界各国普遍关注。我国在1987年就发现由此菌引起的散在感染,近几年已陆续有十多个省份在食品、家禽、家畜、昆虫和腹泻病患者中检出该致病菌,存在着疫情暴发、流行的潜在威胁。大肠杆菌O157是EHEC的主要血清型菌株,成为近年来食品卫生、给水卫生及流行病学领域最重要的研究对象之一。由于大肠杆菌O157感染剂量极低,食入不足100个细菌就可引起疾病,且病程急,病情严重;此外除临床样品外,对水及食品等微生物区系复杂的样品进行检测时,在这些样品中致病菌的数量可能很少,因此筛检大肠杆菌O157的方法是否灵敏、特异及快速至关重要[1]。

传统的聚合酶链反应(PCR)是目前检测大肠杆菌O157的基因诊断技术中最常用的方法之一, 传统的PCR法能将微量标本进行快速扩增,但在特异性、简便程度、温度和试剂仪器要求等方面有缺点[2、6]。随着分子生物学的发展和不断对传统核酸扩增技术的改进,一种新的环介导恒温核酸扩增技术解决了目前基因检测的弊端[3]。LAMP技术利用Bst DNA聚合酶和根据不同靶序列设计的两对特殊的内、外引物，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应。LAMP反应中，内引物杂交在目标DNA区，启动互补链合成，导致哑铃状DNA产生。这种结构很快以自身为模板，进行DNA合成延伸，形成茎-环DNA结构，这个茎-环结构DNA作为LAMP循环的起始结构。由于内引物杂交在茎-环的环上，引物链置换合成的DNA产生一个有缺口的茎-环DNA中间媒介，在茎上附有目标序列。再通过外引物，在茎的末端形成环状结构，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物[3~5]。在LAMP反应过程中，从dNTP 析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物-焦磷酸镁乳白色沉淀或加入荧光染料，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温（63℃左右）进行的。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使得仪器简单化。LAMP技术是在传统的PCR基础上创建的一种理想的手段，其特点是：①只需一恒定温度就能扩增反应。不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性；②高特异性：应用六个区段，四条引物，并且这六个区段的顺序也有规定。原理上LAMP 法扩增的特异性很高，可以根据是否扩增判断目标基因的存在与否，即能够进行病原微生物的定性检测；③快速、高效扩增：扩增在不到1h 即可完成，且产率高。若在引物上再进一步改进,可大大提高其扩增效率，扩增时间在原来的基础上减少；④灵敏度高：扩增模板可达10 拷贝或更少，检测线性范围5个数量级；而且，研究人员或检测人员实际操作非常简便[3~6]。

我们观察到，使用该方法检测肠出血性大肠杆菌O157的灵敏性非常高，与目前常用的传统的PCR法相比，在待测DNA稀释到105时PCR法就难于进行准确的检测了，而LAMP法在标本稀释到108时仍然能够获得较好的扩增结果。在特异性实验中LAMP法也表现出较高的适应度，没有发现假阳性结果的出现。因此，可以认为 LAMP 法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。而且不需要特殊的试剂和仪器设备，因此绝对可以建立起总成本低廉的检测体系。该方法适用于现场检测和大量样品高通量检测，在临床感染性疾病诊断及食品卫生检验等领域具有广阔的应用前景。

参考文献

[1] 夏涵,府伟灵,陈鸣等.快速提取细菌DNA方法的研究[J].现代预防医学,2005,32(3)：571~573.

[2] Maruyama F, Kenzaka T, Yamaguchi N, Tani K, et al. Detection of bacteria carrying the stx2 gene by in situ loop- mediated isothermal amplification.[J]. Appl Environ Microbiol. 2003;69(8)：5023- 8.

[3] Nagamine K, Watanabe K, Ohtsuka K, et al.Loop- mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template[J].Clin Chem.2001;47(9)：1742- 3.

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[5] Thekisoe OM, Inoue N, Kuboki N, et al.Evaluation of loop- mediated isothermal amplification (LAMP), PCR and parasitological tests for detection of Trypanosoma evansi in experimentally infected pigs. Vet Parasitol. 2005;130(3- 4)：327- 30.

[6] Soliman H, El- Matbouli M.Reverse transcription loop- mediated isothermal amplification (RT- LAMP)for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS).Vet Microbiol. 2005 102(8)：309- 11.

*基金项目：2007年深圳市科技计划项目（医疗卫生类）200702117

注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文”