人脂肪间充质干细胞向表皮细胞表型转化的研究

[摘要]目的：探索人脂肪间充质干细胞（adipose derived mesenchymal stem cells，ADSCs）向表皮细胞表型转化的方法。方法：以手术中剩余的人皮下脂肪组织为材料来源，利用胶原酶消化法分离 ADSCs，流式细胞仪检测细胞表面标记CD29、CD90、CD105的表达，成脂诱导后油红O染色鉴定。实验组利用第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科实验室已成功构建的 pcDNA3.1（+）/SP+EGF质粒经脂质体介导转染的HaCat细胞，与 ADSCs在 Transwell小室中共培养，对照组为 ADSCs加入10% FBS 培养基，14天后 Realtime-PCR检测两组 ADSCs 中 CK19、integrin-β的 mRNA 表达量。结果：实验组ADSCs中 CK19、integrin-β的mRNA 表达量较对照组明显升高，且差别有统计学意义。结论：转染EGF的HaCat细胞可诱导ADSCs向表皮细胞表型分化，从而为其成为组织工程理想的种子细胞提供了进一步的支持。

[关键词]脂肪间充质干细胞；HaCat细胞；表皮细胞；组织工程

[中图分类号]R751 R64 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2014）22-1900-04

Cellular phenotype transdifferentiation of human adipose derived mesenchymal stem cells to epithelial cells

ZHAO Zhou-ting1，HU Da-hai2，TAO Ke2，LIU Jia-qi2，ZHANG Zhan-feng2，BAI Xiao-zhi2

（1.Department of E.N.T，The 211st Hospital of PLA，Harbin 150080，Heilongjiang，China；2. Burns Center of PLA，Department of Burns and Cutaneous Surgery，Xijing Hospital，The Fourth Military Medical University，Xi"an 710032，Shaanxi，China）

Abstract： Objective To explore a method that inverts human adipose derived mesenchymal stem cells into epithelial cells. Methods The subcutaneous adipose tissue was collected from the operation. Primary ADSCs were isolated subsequently by the methods of stirring digestion within collagenase type Ⅰ.The membrane antigens expression of cells，such as CD29，CD90， CD105 were detected through flowcytometry （ FCM ）. Adipocyte differentiation cells were stained for fat vacuoles using the Oil red O staining kit. The experiment group used pcDNA3.1（+）/SP-hEGF modified HaCat cells that was successfully created from our laboratory，and co-cultured with ADSCs in Transwell.The control group was DMEM supplemented with fetal bovine serum for ADSCs.After inducing two weeks，the expression of CK19 and integrin-β mRNA were assessed by quantitative realtime PCR. Results The expression level of CK19 and integrin-β mRNA in the experiment group were obviously more than the control group， and there were significant statistical differences between two groups. Conclutions EGF transfected HaCat cells could induce ADSCs to invert to epithelial cells， which will further make ADSCs as ideal seed cells for tissue engineering.

Key words：adipose derived mesenchymal stem cells；HaCat cells；epithelial cells；tissue engineering

皮肤缺损是外科领域的常见问题，尽早封闭创面，减少机体消耗和内环境紊乱是治疗皮肤缺损的关键。烧伤外科中大面积烧伤患者皮源缺乏，自体皮肤移植是目前临床治疗全层皮肤缺损最有效的方法。但是自体刃厚皮移植皮片易收缩，不耐摩擦，中厚皮有瘢痕挛缩等问题。随着组织工程技术的发展，皮肤替代物的研究取得了实质性的进展。种子细胞的体外培养、扩增是组织工程学研究中最基础的工作。

2001年，Zuk等[1]首次分离培养出能够自我复制、稳定增殖，并具有多向分化潜能的脂肪间充质干细胞。ADSCs来自中胚层，在特定条件下可分化为脂肪、骨、软骨、心肌细胞、肝细胞、神经细胞等[1-5]。ADSCs 具有来源丰富、方便取材、低免疫原性、容易体外扩增等优点，在组织工程、创面修复及基因治疗方面具有良好的应用前景。近年研究表明，ADSCs在体外培养过程中加入不同的刺激因子，模拟皮肤的微环境，能诱导成为具有各种表型的细胞。Ramos等[6]证实，将分选纯化后的 ADSCs 植入裸鼠体内，可显著促进创面愈合，且具有表皮细胞再生的能力。Derby等[7]将转染 GFP+的 ADSCs 植入小鼠体内，8周后可检测出表皮细胞的标记物p63，证实通过脂肪移植 ADSCs 可转化为表皮细胞。人角质形成细胞是皮肤创面修复的重要细胞，而表皮生长因子（epithelial growth factor，EGF）是创面修复过程中的关键因子。EGF能促进细胞增殖、表皮再生、血管形成，同时能刺激表皮细胞合成分泌胶原、透明质酸等细胞外基质，促进结缔组织细胞的生长[8]。Shikiji等[9]成功地应用EGF诱导体外培养于立体胶原表面的人表皮细胞向胶原内生长并形成汗腺管结构。因此，本实验研究利用 pcDNA3.1（+）/SP+EGF 质粒经脂质体介导转染的 HaCat 细胞诱导人 ADSCs 体外转化为表皮细胞表型的可行性，为其在组织工程中的应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1主要仪器与试剂：Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、IBMX、地塞米松、胰岛素、吲哚美辛均购自美国Sigma公司，CD29、CD90、CD105鼠抗人多克隆抗体购自美国 Bio Legend公司，TRIZOL购自美国Invitrogen 公司，反转录试剂盒、 SYBR Green荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa生物工程公司，流式细胞仪购自美国Becton-Dickinson 公司、DU800 型分光光度计购自美国Beckman CouLter公司，iQ5TM荧光定量 PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2ADSCs的分离培养：无菌条件下取外科手术后剩余人体腹部皮下脂肪组织（患者知情同意）约10g，于1h内送至实验室。在超净台内于含青霉素（300U/mL）、链霉素（300μg/mL）的PBS液中浸泡 10min，PBS冲洗，眼科剪将脂肪组织反复剪碎至1 mm×1mm大小，加入约10ml的0.1%Ⅰ型胶原酶，于 37℃水浴锅内剧烈震荡消化1h，加入10ml的10%FBS 中和胶原酶，离心，弃上清，重悬，200目筛网过滤，离心，弃上清，重悬，将细胞种植于25cm2细胞培养瓶中，置于37℃、体积分数为 5%的CO2孵育箱中。

1.3ADSCs 的鉴定

1.3.1 流式细胞仪：取生长良好的第三代细胞，制成5×107/mL单细胞悬液，分别加入荧光标记的鼠抗人多克隆抗体CD29、CD90、CD105 各20μl，加入细胞悬液，混匀，离心，流式细胞仪检测。

1.3.2 诱导 ADSCs 向脂肪细胞定向分化：待细胞生长至80%～90%融合时，加入成脂诱导培养基[10] ：10%FBS，DMEM，0.5mmol/L IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤），1μmol/L 地塞米松，10μmol/L 胰岛素，200μmol/L吲哚美辛。

1.4 ELISA检测HaCat-hEGF细胞中EGF含量：本实验室用pcDNA3.1（+）/SP+EGF 质粒经脂质体介导转染 HaCat细胞，经G418长期筛选已成功获得稳定分泌人表皮生长因子的细胞株。分别收集24、48、72h内HaCat-EGF细胞的无血清上清液，检测方法按照检测试剂盒使用说明进行，具体步骤如下：待测品孔每孔加入待测样品100μL，将反应板充分混匀后置于37℃，120min，用洗涤液充分洗涤反应板 4～6次，在滤纸上印干，每孔加一抗工作液 100μL，混匀后置于 37℃，60min，洗板，每孔加入酶标抗体工作液 100μL，置 37℃，60min，洗板，每孔加入100μL底物工作液，置 37℃暗处反应 15min，每孔加入100μL终止液混匀，在酶标仪上 450nm 处测吸光度（OD值）。

1.5 实验分组：分为1个实验组和1个对照组。实验组为Transwell小室共培养，上室为 HaCat-hEGF细胞，下室为ADSCs，加入10%FBS培养基，对照组为 ADSCs加 10%FBS 培养基。培养14天后用TRIZOL提取总RNA，按说明进行操作。

1.6 反转录：利用反转录试剂盒合成cDNA，反应体系为10μL。具体体系为：5×Buffer 2μL，RT 酶 0.5μL，Oligo·dt 引物（ 50μmol/L ） 0.5μL，6-mer （100μmol/L）0.5μL，RNA 1μg，ddH2O 5.5μL，补足 10μL 反应体系。反应条件：37℃，15min，85℃，5s。

1.7 引物设计：以下引物均由TaKaRa生物工程公司设计并合成。

1.8 SYBR Green实时荧光定量PCR检测ADSCs中 CK19、integrin-βmRNA表达：反应体系为20μL，SYBR Green混合液10μL，P1（10μmol/L）0.5μL，P2（10μmol/L）0.5μL，cDNA2μL，ddH2O 7μL。反应条件为：预变性95℃ 30s，变性95℃ 10s，退火 60℃ 10s，共40个扩增循环。以GAPDH为内参，CK19、integrin-β为阳性对照，每个样品基因设3个复管。利用iQ5TM 荧光定量PCR仪进行SYBR Green荧光定量 PCR 分析，实验结果用iQ5软件行CT相对定量分析。

1.9 统计学分析：采用SPSS10.0统计软件包进行统计学处理，数据以均数±标准差（x±s）表示，组间对比采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD-t 检验，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞培养如图1～2。

2.2细胞表面标记物：经流式细胞仪检测，ADSCs 均一表达CD29、CD90、CD105，阳性率分别为73.4%、97.3%和80.4%。

2.3油红O染色鉴定 ADSCs 向脂肪细胞定向分化：

诱导1周后可见细胞内有大小不一的脂滴形成，油红O染色后可见脂滴被染成橙红色（如图3）。

2.4 HaCat-EGF 细胞中 EGF 分泌量：经 ELISA 试剂盒检测，转染 EGF 的 HaCat 细胞24、48、72h EGF的分泌量分别为：492、622、943ng/L（如图4）。

2.5 SYBR Green实时荧光定量 PCR 检测 ADSCs mRNA 水平（如图5）。

3 讨论

ADSCs 凭借其来源丰富、取材容易、对机体损伤小、体外增殖迅速、生物学性状稳定等优点，已成为细胞移植及组织工程理想的种子细胞，是人体干细胞库潜在的重要来源。本实验从外科手术中剩余的腹部皮下脂肪组织为来源，采用胶原酶消化法及 DMEM培养法分离得到细胞。目前，CD29、CD90、CD105被公认为具有多向分化潜能细胞的标记分子，而造血细胞及内皮细胞的标记分子，如 CD34 在ADSCs 中是否表达却存在争议。在本实验中，ADSCs 经流式细胞仪分析证实CD29、CD90、CD105 表达为阳性。干细胞与终末分化细胞的不同之处不仅在于细胞表面标记分子表达情况不同，而且前者具有多向分化的能力，因此鉴定 ADSCs 最好的方法是进行多向分化诱导并进行相应检测以确定诱导成功。故本实验采用成脂诱导分化实验对培养细胞的干细胞特性进行鉴定。

本实验利用pcDNA3.1（+）/SP+EGF质粒经脂质体介导转染的HaCat细胞与ADSCs共培养，通过转染EGF的HaCat 细胞分泌EGF，以及HaCat细胞分泌的其他细胞因子作用于ADSCs，使 ADSCs向表皮细胞表型转化。构建的EGF基因表达载体不但可以经体外培养及活体途径转入人角质形成细胞，同时可借助外分泌机制参与对邻近细胞的生长调控。CK19、integrin-β被认为是表皮干细胞的重要标记物[11-12]。研究表明，缺少integrin-β 会严重影响表皮的分化和形成，其介导表皮干细胞与细胞外基质的粘附，还调控终末分化的启动[13]。因此，本研究选择CK19、integrin-β 作为检测 ADSCs 分化的指标。

本实验成功诱导了ADSCs向表皮细胞表型的定向分化，对临床上解决大面积烧伤、严重创伤病人的皮源紧缺以及促进创面修复等问题提供了新的探索途径，为ADSCs成为表皮组织工程学研究的理想种子细胞奠定了基础。

[参考文献]

[1]Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，et al. Multilineage cells from human adipose tissue：implications for cell-based therapies[J].Tissue Eng，2001，7（2）：211-228.

[2]Winter A，Breit S，Parsch D，et al. Cartilage-like gene expression in differentiated human stem cell spheriods： a comparison of bone marrow-derived and adipose tissue-derived stromal cells[J]. Arthritis Rheum，2003，48（2）：418-429.

[3]Safford KM，Hicok KC，Safford SD，et al. Neuogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells[J]. Biochem Biophys Res Commun，2002，294（2）： 371-379.

[4]Rangappa S，Fen C，Lee EH，et al. Transformation of adult mesenchymal stem cells isolated from the fatty tissue into cardiomyocytes[J].Ann Thorac Surg，2003，75（3）：775-779.

[5]Lu F，Mizuno H，Uysal CA，et al.Improved viability of random pattern skin flaps through the use of adipose-derived stem cells[J].Plast Reconstr Surg，2008，121（1）： 50-58.

[6]Ramos TV，Wang T，Maki CB，et al.Adipose stem cell side population in the mouse[J].J Tissue Eng Regen Med，2009，3（6）：430-441.

[7]Derby BM，Dai H，Reichensperger J，et al. Adipose-derived stem cell to epithelial stem cell transdifferentiation： a mechanism to potentially improve understanding of fat grafting"s impact on skin rejuvenation[J]. Aesthet Surg J，2014，34（1）：142-153.

[8]Gope R.The Effect of Epidermal Growth factor and platelet-derived growth factors on wound healing process[J].Indian J Med Res，2002，116（11）：201-206.

[9]Shikiji T，Minami M，Inoue T，et al. Keratinocytes can differentiate into eccrine sweat ducts in vitro： involvement of epidermal growth factor and fetal bovine serum[J].J Dermatol Sci，2003，33（3）： 141-150.

[10]Zuk PA，Zhu M，Ashjian P，et al.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[J].Mol Biol Cell，2002，13（12）： 4279-4295.

[11]Michel M，Torok N，Godbout MJ，et al. Keratin 19 as a biochemical marker of skin stem cells in vivo and in vitro： Keratin 19 expressing cells are differentially localized in function of anatomic sites， and their number varies with donor age and culture stage[J].J Cell Sci，1996，109（5）： 1017-1028.

[12]Jones PH，Watt FM.Separation of human epidermal stem cells from transit amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression[J].Cell，1993，73（4）：713-724.

[13]Bagutti C，Hutter C，Chiquet-Ehrismann R， et al.Dermal fibroblast-derived growth factors restore the ability of beta （1） intergrin-deficient embryonal stem cells to differentiate into keratinocytes[J].Dev Biol，2001，231（2）：321-333.

[收稿日期]2014-09-11 [修回日期]2014-10-05

编辑/何志斌