乌珠穆沁羊生长过程中肌纤维类型的变化

材料与方法

1.1 材料与试剂

选取自然放牧环境下的1、3、6、9、12、18月龄的乌珠穆沁羊，同一个羊群中各月龄分别取3只。屠宰后取其股二头肌，将样品分装，装入冻存管中直接投入液氮中速冻，放-80℃冰箱保存。

二甲苯、甘油、Tris、甘氨酸、乙二胺四乙酸二钠（EDTA） 南京市新源化工有限公司；三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、十二烷基硫酸钠（SDS）、β-巯基乙醇 生工生物工程（上海）股份有限公司；巴比妥钠 上海紫一试剂厂；无水乙醇、乙酸钠 天津市绿源生态能源有限公司；氯化钴 郑州天邦化工有限公司；硫化铵 上海至鑫化工有限公司；盐酸 山东三方化工集团；四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵（APS） 上海叶舟生物科技有限公司；溴酸蓝、考马斯亮蓝 G-250 沈阳市新光化工厂。

1.2 仪器与设备

PB-10型pH计 北京赛多利斯科学仪器公司；平衡补风型通风柜 北京世安科兴科技开发有限责任公司；DSH-300A型回旋式恒温水浴振荡器 上海雅荣生化设备仪器有限公司；Tissue-Tek衡冷冻切片机 德国SLEE公司；CX31光学显微镜 日本Olympus光学株式会社；Arium 61316超纯水器 北京赛多利斯仪器厂；85-2型磁力搅拌器 北京国华科技有限公司；BG-power 600通用电泳仪 北京百晶生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品冷冻切片处理

将样品从-80℃冰箱取出，-20℃环境下静置30min～1h，迅速修成1.5cm×1.5cm×1.5cm的小块，在恒温冷冻切片机上-20℃切片，厚为12μm，立即粘贴于准备好的载玻片的正面，室温条件下干燥完全即可进行染色。

1.3.2 组织化学染色

采用Schiaffino等[13]的腺苷三磷酸酶（ATPase）染色法。将干燥完全的切片于多聚甲醛固定液中固定，蒸馏水冲洗后置酸性和碱性孵育液中孵育，巴比妥钠溶液冲洗，硫化铵溶液静置，常规梯度乙醇脱水，中性树胶封固。用光学显微镜观察。

1.3.3 肌球蛋白的提取

参考Light等[14]的方法。取去掉脂肪和大块的结缔组织的肌肉组织，切碎，再次去掉较细的结缔组织，加入匀浆液进行匀浆处理，冰上静置，超高速离心，分注上清液，放入-20℃保存。

1.3.4 SDS-PAGE电泳分离肌球蛋白重锁异构体

参考Light等[14]的方法进行分离。分离胶混匀后迅速注入两块凝胶板中，轻点少量蒸馏水，不要让凝胶板移动，倾斜模具见凝胶成斜直线，用滤纸吸干上面的蒸馏水。浓缩胶注在分离胶之上，插进电泳梳子，4℃凝胶。凝好后缓慢拔出，放置于电泳槽中，下槽注入电泳缓冲液（lower buffer），上槽中注入电极缓冲液（upper buffer）。将样品按月龄顺序注入胶孔。进行电泳，至凝胶板中的蓝紫色线离下端1.5cm处停止电泳。取下凝胶板4℃染色、4℃脱色，直至条带清晰。

2 结果与分析

2.1 骨骼肌肌纤维类型分布

A. 1月龄

B. 3月龄

C. 6月龄

D. 9月龄

E. 12月龄

F. 18月龄

图1是经ATPsae染色后，不同月龄生长阶段乌珠穆沁羊中股二头肌肌纤维类型的分类图像。如图1中箭头所指：黑色（最深色）的是Ⅰ型，白色（浅色）的是Ⅱa型，棕色（中间色）是Ⅱb型。

由表1可知，股二头肌中Ⅰ型肌纤维在1、3、6、9月龄有逐渐降低趋势，12月龄时百分含量增加，9、18月龄时百分含量较低，除了6、12月龄外其他月龄之间差异均显著（P<0.05）。Ⅱa型肌纤维百分含量在3、6月龄及12、18月龄之间差异不显著（P>0.05）。Ⅱb型肌纤维百分含量在1、3、6月龄显著上升（P<0.05），6月龄和9月龄差异不显著（P>0.05），9、12、18月龄之间差异均显著（P<0.05），百分含量在18月龄达到最高。

2.2 骨骼肌中肌球蛋白重锁异构体

肌球蛋白重锁异构体通常能够确定肌纤维的类型[15]。之所以能将肌球蛋白中的重锁异构体进行区分是由于其在电泳凝胶中的移动速率不同[16]。图2是对乌珠穆沁羊不同月龄股二头肌中肌球蛋白提取并进行SDS-PAGE电泳图，从图2可以看到比较明显的条带分别为I型、Ⅱb型与Ⅱa型。这一结果与ATPase染色结果相一致，说明在股二头肌中确实存在这三种类型的肌纤维。

动物在生长过程中，受不同品种、月份变化、外界条件、饲养条件、肌肉分布等因素的影响，骨骼肌中不同肌纤维类型能够相互转化[17]。刚出生后的动物白肌较少，在生长过程中红肌纤维数量逐渐增多，但纯红色肌纤维不引起出生后分化[18]。Ⅰ型肌纤维百分比含量在9、18月龄下降的原因可能与脂肪含量有关。

肌纤维类型的组成比例、特性以及生理、生化的不同与肉品质、产肉量以及口感等性能方面有着密切联系[20]。刘艳芬等[21]对中国地方猪种的骨骼肌肌纤维类型进行研究，在刚出生时，红肌和白肌的组成没有明显区别，到生长后期白肌纤维含量较低，肉质粗糙；白肌纤维径度大于红肌纤维，产肉量会偏高。研究表明[22]，肌纤维类型组成比例与产肉能力，尤其是与胴体质量和脂肪杂交有紧密联系。白色肌纤维的组成比例越低越有劣质的脂肪交杂，没有经过杂交改良的品种则红色肌纤维增多，可增加肉的风味性。此外，自然圈养畜肉更能积累营养物质，增加一些风味物质，如一些不饱和脂肪酸成分[23]。

因此，自然条件下乌珠穆沁羊生长过程中肌纤维类型的变化受外界天然环境的影响。环境变化对肉品质以及产肉性能的提高也会产生影响。了解在自然条件下乌珠穆沁羊的生长变化规律，对我国地方优良品种肉质的改善，草原畜牧业生产和畜产品加工具有重要的实际意义。

3 结 论

随着月龄的增加乌珠穆沁羊股二头肌中Ⅰ型纤维百分含量在1月龄时最高，18月龄时最低。Ⅱa型肌纤维百分含量在12月龄时最高，6月龄时百分含量最低。Ⅱb型纤维百分含量在1月龄时最低，18月龄最高。整体上看，乌珠穆沁羊在生长过程中Ⅰ型、Ⅱb型肌纤维百分含量变化较大，Ⅱa纤维百分含量相对稳定。肌纤维类型的组成直接影响羊肉品质，通过对肉羊不同生长阶段肌纤维类型变化规律进行研究，了解地方优良品种羊肉的肌纤维特点，为肉品质控制方面（如嫩度、水分含量等）、肉质的提高和改善提供理论依据。

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