纳洛酮对油酸型ARDS大鼠血清中心房钠尿肽、B型脑钠肽及肺组织Na+—K+—ATP酶含量的影响研究

材料与方法

1.1 实验材料

油酸（沈阳市东兴试剂厂），盐酸纳洛酮注射液（北京凯因科技股份有限公司），ANP酶链免疫吸附（ELISA）试剂盒（加拿大HCB公司产品），BNP酶链免疫吸附（ELISA）试剂盒（加拿大HCB公司产品），NKA测试盒（南京建成生物工程研究所），BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所）。

1.2 动物及分组

2014年1月～2015年1月选取SD大鼠30只，雌雄不拘，体质量（200±20）g，由延边大学实验动物中心提供[许可证号SCXK（吉）2011-0007]，将大鼠随机分为正常组、ARDS模型组、纳洛酮治疗组各10只。由大鼠左下腹注入20%乌拉坦1.0 g/kg正腹腔麻醉，剥离股动脉和股静脉，并将自制静脉管插入股静脉。正常组：向股静脉缓慢注入0.9%生理盐水4.1 mL/kg。ARDS模型组：先注入油酸0.1 mL/kg及0.9%生理盐水4.0 mL/kg。纳洛酮治疗组：建立模型，随即注入纳洛酮注射液1.0 mg/kg及0.9%生理盐水2.0 mL/kg。

1.3 生物材料的制备

给药后3 h，腹主动脉采血，离心分离血清，-40℃冻存，待测ANP、BNP。腹主动脉采血后处死大鼠，取左肺称取湿重，置于68℃恒温箱48 h完全脱水后称取干重，计算左肺湿/干重比值。取右肺上叶，制作成蜡块，行HE染色，光镜下观察肺组织病理改变；取右肺下叶混合树脂包埋，行双重染色，电镜下观察肺组织病理改变。取右肺中叶制备成组织匀浆，取上清液，冻存，待测NKA活性、组织总蛋白。

1.4 生物化学指标检测

血清ANP、BNP及肺组织NKA活性检测均严格按照说明书进行操作并计算。

1.5 统计学分析

采用SPSS17.0统计学软件，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，行方差分析和t检验；左肺湿/干重比值与相关指标的关系采用Pearson相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠左肺湿/干重比值、血清中ANP、BNP含量比较

ARDS模型组、纳洛酮治疗组大鼠左肺湿/干重比值、血清中ANP、BNP含量与正常组比较均明显升高（P<0.01），而纳洛酮治疗组与ARDS模型组比较下降（P<0.01），ARDS模型组、纳洛酮治疗组肺组织Na+-K+-ATP活性与正常组比较均明显下降（P<0.01），而纳洛酮治疗组与ARDS模型组比较明显升高（P<0.01）。见表1。

2.2 肺组织Na+-K+-ATPase活性、血清ANP、BNP与左肺湿/干重比值相关分析

相关系数r分别为-0.901、0.945、0.935，P值分别为0.001、0.001、0.001（P<0.01）。

2.3 病理学观察结果

2.3.1 肺组织病理切片光镜下观察 ARDS模型组，可见肺间质和肺泡内水肿，灶性或大片的肺泡萎缩，大量中性粒细胞浸润，部分可见透明膜形成；纳洛酮治疗组上述表现较轻，未见透明膜形成，正常组无上述改变。见封三图1～4。

2.3.2 肺组织病理切片电镜下观察 ARDS模型组Ⅰ型肺泡上皮细胞及内皮细胞肿胀和坏死，Ⅱ型肺泡上皮细胞板层小体变性、破坏、排空现象，见大小不均的空泡，肺泡间隔增宽，纳洛酮治疗组上述变化较轻。见封三图5～7。

3 讨论

Na+-K+-ATP酶（NKA），又称钠泵，即钠-钾泵，简称钠泵，是在哺乳动物的细胞膜上普遍存在的离子泵，广泛存在于各种细胞的细胞膜上，细胞代谢能量的1/3以上用于钠泵的运转，具有重要的生理意义。通过研究发现，NKA的活性在活体细胞的总活性中只占其1/3，其活性可能是因为氧化应激、缺O2、心房尿钠肽、麻醉所损害[5，6]。ARDS时因为肺泡上皮细胞膜上的NKA活性下降，造成肺组织清除液体能力下降[7]。ARDS是以损害毛细血管内皮细胞及肺泡上皮细胞，使其增加肺通透性，肺间质及肺泡水肿为病理基础，而机体内有效的气体交换过程中，维持肺泡内相对干燥环境，肺组织主动转运系统中的NKA起着重要作用。本实验结果表明，油酸所致ARDS大鼠模型中NKA活性下降，与左肺湿/干重比值呈负相关，提示NKA可作为观察ARDS动物模型疾病轻重指标，且在肺水肿形成过程中起重要作用。

1981年De-Bole等[8]首次发现ANP，心房钠尿肽（ANP）主要由心房肌细胞分泌，具有强大的利钠利尿作用，是参与体内体液调解的重要激素之一。右心房释放心房钠尿肽后的第一个靶器官和清除场地是肺，因此ANP对肺通气功能与肺循环起关键调节作用。ANP在呼吸系统疾病中主要起到的作用为扩张支气管、降低肺动脉高压、调节通透性、抑制炎症细胞因子分泌等[9，10]。本实验结果表明，油酸所致ARDS大鼠模型中ANP水平明显升高，与正常组比较差异有显著性，ANP与左肺湿/干重比值呈正相关，以上表明ANP可能间接反映肺水肿及肺损伤严重程度。

BNP属于利钠肽家族成员之一，具有强大的利钠、利尿以及血管扩张的作用。BNP主要在肺循环中代谢，ARDS时肺毛细血管网受损伤，肺对BNP消灭能力降低。研究还显示炎症因子（主要是IL-1β、IL-6、TNF-α）释放、交感神经系统兴奋促使BNP释放。正常肺由肺泡上皮和肺微血管内皮细胞构成良好的肺泡-毛细血管屏障。ARDS显著的组织学特征就是肺微血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤，肺血管通透性增加，这种肺毛细血管网严重破坏，对BNP的降解清除能力下降。ARDS存在肺内微循环障碍，引起肺循环高凝状态，肺内微血栓形成，肺动脉压升高，致右心负荷过重，导致血浆BNP的升高[11-13]。本实验结果表明，油酸所致ARDS动物模型中BNP水平明显升高，与正常组比较差异有显著性，BNP与左肺湿/干重比值呈正相关，以上表明BNP是ARDS发病机制中产生肺水肿的因素之一。

纳洛酮为内源、非特异性阿片受体阻断剂，脂溶性高，并迅速分布全身，尤以脑、肺、肾和心脏中浓度较高。本实验结果表明纳洛酮治疗组大鼠左肺W/D、血清ANP、BNP含量一定程度降低，Na+-K+-ATP酶活性升高与ARDS模型组比较差异有显著性。光镜及电镜病理改变较ARDS模型组轻，表明纳洛酮对油酸型ARDS大鼠有一定的治疗作用。这可能与纳洛酮稳定溶酶体膜、保护细胞功能、改善微循环、降低内皮素和肿瘤坏死因子水平等作用[14，15]；恢复NKA功能，减少肺水肿，减少ANP和BNP在肺部释放，从而程度不等的降低肺水肿及肺动脉高压的发生率等有关。

[参考文献]

[1] 穆恩，马晓春. 抗凝治疗-急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征治疗的新思路[J]. 中国危重病急救医学，2011，23（1）：55.

[2] 李有香. 成人急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征患者的无创和有创通气治疗新进展[J]. 中国老年学杂志，2013， 33（14）：3531.

[3] Heuer JF，Pelosi P，Permann P，et al. Acute effects of intracranial hypertension and ARDS on pulmonary and neuronal damage：A randomized experimental studay in pigs[J].Intensive Care Med，2011，37（7）：1182-1191.

[4] 黄莉花. 纳洛酮对油酸型大鼠急性呼吸窘迫综合征的影响研究[D]. 延边大学，2014.

[5] Adir Y，Factor P，Dumasium V，et al. Na-K-ATPase gene transfer increases liquid clearance during ventilation-induced lung injury[J]. Am J Respir Crit Care Med，2003，168（12）：1445-1448.

[6] 李丽琳. 油酸致大鼠急性呼吸窘迫综合征机制及丹参多酚酸盐对其影响研究[D]. 延边大学，2013.

[7] Sznajder JI，Factor P，Ingbar DH. Inviteed review：Lung edema clearance：role of Na+-K+-ATPase[J]. J Appl Physiol，2002，93（5）：1860-1866.

[8] De-Bole AJ，Borenstein HB，Veress AT，et al. A rapid and potent natriuretic response to intravenous injection of atrial myocardial extracts in rats[J]. Life Sci，1981，28（1）：89-94.

[9] 刘晓静，刘雪梅，魏萍. 慢性肺源性心脏病患者心钠素的检测价值[J]. 实用心脑肺血管病杂志，2013，21（6）：139-140.

[10] 许文水. 心房脑钠肽对急性肺损伤SD大鼠肺泡灌洗液中乳酸脱氢酶和总蛋白及总磷脂含量的影响[J]. 实用心脑肺血管病杂志，2013，21（6）：147-149.

[11] Bozkarnat E，Tozkoparan E，Bavsan O，et al. The significance of elevated brain natriuretic peptide levels in chronic obstructive pulmonary disease[J]. J Int Med Res，2005，33（5）：537-544.

[12] 张经文. 肠道屏障在重症急性胰腺炎肺损伤发病机制中的作用及中西药物干预的实验研究[D]. 大连医科大学，2012.

[13] 胡玉杰. 桃仁承气汤治疗急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征（ALI/ARDS）的实验研究[D]. 河北医科大学，2014.

[14] Wollemann M，Benyhe S. No-opioid action，of opiold peptides[J]. Life Sei，2004，75（3）：257-270.

[15] 房树娟，加孔那·托哈依. 纳洛酮的作用机制及其在呼吸系统疾病中的临床应用[J]. 国际呼吸杂志，2009，29（13）：812-815.

（收稿日期：2016-03-28）