动物源性食品鸭血中鸭成分普通PCR检测方法探究

报告的单位和企业，只能用国家标准进行检测，本文对SN/T 3731.5-2013检测鸭血样品中鸭成分因鸭血DNA部分降解而导致结果偏离进行了方法优化探索，以提高检测结果的准确性。

材料与方法

材料与试剂鸭血：购自南京某大型超市。

DNA提取试剂盒TaKaRa MiniBEST UniversaI GenomicDNA Extraction Kit ver 5.0、TaKaRa Taq（5U/uL）、10×PCRBuffer（Mg²⁺ pIus）、dNTP Mixture（各2.5mM）、PCR体系预混液Premix EX TaqTM（Probe qPCR）宝生物工程（大连）有限公司。

仪器和设备：EPS 300电泳仪Tanon；UniversaIGenoSensl800凝胶成像仪：上海勤翔；ABI 2720普通PCR仪美国赛默飞PikoREAL 96实时荧光定量PCR仪（96孔板）：美国赛默飞。

引物：参照标准合成扩增鸭源性成分的引物，引物序列见标准表1。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

DNA提取方法：鸭血DNA提取方法按照DNA提取试剂盒的方法步骤进行提取。

普通PCR检测：鸭血中鸭成分检测步骤见SN/T3731.5-2013。

实时荧光定量PCR检测：将鸭血所提DNA进行鸭源性成分的实时荧光定量PCR检测，PCR反应体系为：预混液20ML，包括DNA模板1.6uL，Premix Ex TaqTM（ProbeqPCR）10uL，上下游引物各0.4uL，Probe 0.8uL，加ddH20补足20uL。

鸭成分实时荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性30s；PCR反应：95℃ 5s，60℃ 30s，进行40个循环。根据扩增曲线Ct值≤35视为检出鸭成分。

增加模板进行扩增检测：将鸭血DNA添加不同模板量进行扩增，即PCR反应体系中DNA模板分别添加1uL、2uL、5uL、10uL，反应体系和反应条件见SN/T 3731.5-2013。扩增产物进行电泳检测。

二次扩增：将1.7扩增后的产物取2uL加入98uLddH₂O进行100倍稀释，取1uL作为模板进行二次扩增，反应体系和反应条件见SN/T 3731.5-2013。扩增产物进行电泳检测。

结果与分析

鸭血样品普通PCR和实时荧光定量PCR检测结果：对提取的鸭血DNA利用鸭源性引物进行PCR扩增，反应产物经琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，结果见图1。对提取的鸭血DNA利用鸭源性引物进行实时荧光定量PCR，结果见图2。

由图1可知，空白对照和阴性对照无条带产生，阳性对照在226bp有条带产生，鸭血DNA扩增后在226bp位置无可见条带，未检出鸭成分。由图2可知，实时荧光定量PCR检测结果空白对照和阴性对照均为未检出，阳性对照Ct值分别为18.26，检出鸭成分，鸭血两个平行样Ct值分别为23.21/23.95，检出鸭成分。普通PCR与实时荧光定量PCR检测结果不一致，可以推测鸭血中鸭DNA可能受物理、化学等因素的影响，核酸有降解。

增加模板扩增结果：对提取的鸭血DNA添加模板量分别为1uL、2uL、5uL、10uL，利用鸭源性引物进行PCR扩增，反应后取扩增产物，经电泳检测扩增结果，结果见图3。

由图3可以看出，添加鸭血模板量1uL、2uL、5uL、10uL，每个模板梯度各2个平行样，扩增后都是Smear，阳性对照条带正常而且很亮，排除了反应体系及引物的原因。因为鸭血与鸭肉不同，血液的保存期短，储存不了太长时间，基因组降解可能性大。

二次扩增检测结果：由图4可以看出，对鸭血DNA添加不同模板量1uL、2uL、5uL、10uL扩增后的产物，经过1.8步骤进行二次扩增后，空白对照和阴性对照无条带产生，阳性对照在226bD有条带产生，不同模板添加量1uL、2uL、5uL、10uL二次扩增的扩增产物，2uL模板添加量在226bp位置有弱条带，5uL和10uL模板添加量在226bp位置有明亮条带，无非特异性条带，扩增结果良好。

通过增加模板DNA量至5uL后扩增，可以增加目的DNA的含量，通过稀释后，可以降低杂质的含量从而增加目的DNA的含量，提高扩增目的DNA的准确度。目前普通PCR法是国家现有的检测鸭成分的唯一标准方法，是需要出具正式检测报告的检验检测机构的唯一检测方法，而普通PCR法有很大的局限，检测结果不够准确，如果单以SN/T 3731.5-2013方法检测鸭源性成分，可能得到错误的检测结果，因此通过此优化方法来优化检测过程，可以提高检测结果的准确度，可为质检部门及第三方检测机构推广应用，作为实验室检测血液类食品的常规检测手段。